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溃疡性结肠炎（Ulcerative colitis,UC）是一种难治性消化系统疾病,中医将其归属于“久痢”范畴,认为湿邪、热毒、气滞和血瘀是其主要病机。救必应为冬青科植物铁冬青（Ilex rotunda Thunb.）的干燥树皮,具清热解毒、利湿止痛之效。《草药手册》记载,救必应可用于治疗胃及十二指肠溃疡、急性肠胃炎等胃肠系统疾病。现代药理学研究发现,救必应具有抗菌、抗炎和抗肿瘤等多种活性。然而,救必应对UC是否具有治疗作用并不清楚,其物质基础及作用机制尚无研究。因此,本课题对救必应治疗UC的药效学进行评价,并结合药物分析学和药理学研究方法,阐明其治疗UC的物质基础和作用机制。研究方法1.救必应对急、慢性UC小鼠的药效研究采用3%葡聚糖硫酸钠（Dextran sulfate sodium,DSS）自由饮用7天建立急性UC小鼠模型,同时灌胃0.9 g/kg、1.8 g/kg和3.6 g/kg救必应水提物进行预防和治疗给药;采用2%DSS自由饮用7天,自来水饮用14天为一个周期,循环三个周期建立慢性UC小鼠模型,第二个周期开始灌胃0.45 g/kg、0.9 g/kg和1.8 g/kg救必应水提物治疗,第三个周期自来水饮用调整为7天。以巴柳氮钠为阳性对照,通过小鼠体重变化、疾病活动指数（Disease activity index,DAI）评分、结肠长度、结肠组织病理变化、炎症反应及黏膜屏障通透性和完整性等指标评价救必应对急、慢性UC的预防和治疗作用。2.救必应化学成分分析建立UPLC-QTOF-MS/MS方法,通过Waters质谱平台建立救必应化合物库,结合文献信息和化合物质谱碎片信息,对救必应的化学成分进行分析鉴定;建立UPLC-MS/MS方法对救必应中具有生物活性的10个化学成分进行定量。3.救必应治疗UC的功效成分筛选采用LPS刺激Caco2细胞建立肠炎细胞模型,同时体外构建肠道黏膜屏障模型,筛选救必应发挥抗炎和保护肠道黏膜屏障作用的候选功效成分。4.救必应治疗UC的功效成分验证及作用机制利用急性UC小鼠模型,在体验证救必应治疗UC的候选功效成分,并根据其在救必应中的占比关系进行组合,寻找与救必应等效的功效成分组合物。通过转录组测序及PCR验证初步阐明救必应及其功效成分组合物治疗UC的作用机制。研究结果1.救必应对急、慢性UC小鼠具有治疗作用救必应能改善急、慢性UC小鼠的体重降低、DAI评分和脏器系数升高,减轻结肠短缩,改善结肠组织病理损伤,降低全血中的白细胞及结肠组织中促炎细胞因子IL-1β、IL-6 和 TNF-α 的 mRNA、结肠中 p-STAT3、IL-6、OSM 和 OSMR 等炎症蛋白的表达,提高IL-10的mRNA水平,修复结肠上受损的酸性黏液层,促进结肠上皮细胞新生,上调黏膜屏障蛋白ZO-1、Claudin-1和Occludin表达,从而发挥对急、慢性UC的预防和治疗作用。2.鉴定了救必应中23个化学成分通过UPLC-QTOF-MS/MS鉴定得救必应中23个化学成分:6个苯丙素类,分别为紫丁香苷、芥子醛葡萄糖苷、4-咖啡酰基-2-甲基-2-烯-1,4-二羟基异戊烯-1-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、（-）-丁香树脂酚-4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、3,4,5-三甲氧基苯基-5"-O-咖啡酰基-β-D-赤式-呋喃芹糖-（1→6）-β-D-吡喃葡糖糖苷和4-咖啡酰基-3-甲基-2-烯-1,4-二羟基异戊烯-1-O-β-D-吡喃葡萄糖苷;6个齐墩果烷型三萜皂苷类,分别为3β,19α-二羟基-齐墩果酸-3-O-α-L-吡喃阿拉伯糖苷、3β,19α,23-三羟基-齐墩果酸-3-O-β-D-（6’-O-甲酯）-吡喃葡萄糖醛酸苷、3-O-β-D-吡喃葡萄糖醛酸基-3β,19α-二羟基乌苏-12-烯-28-酸-28-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、3β,19α-二羟基-23,28-二羧基-齐墩果酸-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-齐墩果酸-28-O-β-D-吡喃葡萄糖苷和齐墩果酸-28-O-βD-吡喃葡萄糖基-（1→2）-β-D-吡喃葡萄糖醛酸苷;11个乌苏烷型三萜皂苷类,分别为地榆皂苷Ⅱ、救必应酸-28-O-α-D-吡喃葡萄糖酰（1→6）-β-D-吡喃葡萄糖苷、具栖冬青苷、冬青苷K、地榆皂苷I、3β,19α,24-三羟基乌苏-12-烯-28-酸-28-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、毛冬青皂苷甲、铁冬青酸、3-O-β-D-吡喃葡萄糖醛酸基-3β,23-二羟基-齐墩果酸-28-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、3β,19α,24-三羟基乌苏-12-烯-28-酸和冬青素A。UPLC-MS/MS法测得救必应中的紫丁香苷、芥子醛葡萄糖苷、（-）-丁香树脂酚-4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、地榆皂苷Ⅱ、具栖冬青苷、冬青苷K、地榆皂苷Ⅰ、毛冬青皂苷甲、冬青素 A 和铁冬青酸的含量依次为 6.632 mg/g、0.012 mg/g、182.275 mg/g、4.502 mg/g、18.915 mg/g、18.217 mg/g、3.262 mg/g、64.326 mg/g、5.460mg/g和 26.392 mg/g。3.救必应治疗UC的候选功效成分为地榆皂昔Ⅰ、地榆皂苷Ⅱ、紫丁香苷和具栖冬青苷救必应中的地榆皂苷Ⅰ、地榆皂苷Ⅱ、紫丁香苷和具栖冬青苷能降低LPS引起的Caco2细胞炎性蛋白OSM和OSMR的表达,降低肠道黏膜屏障的酚红透过率。此外,地榆皂苷Ⅱ和紫丁香苷还能升高肠道黏膜屏障的跨膜电阻,并上调黏膜屏障蛋白ZO-1、Claudin-1 和 Occludin 表达。4.救必应及其功效成分地榆皂苷Ⅱ、紫丁香苷和具栖冬青苷治疗UC的作用机制与调节细胞因子受体互作信号通路相关救必应中的地榆皂苷Ⅱ和紫丁香苷能改善急性UC小鼠的体重降低、DAI评分升高及结肠萎缩等病理症状,减轻结肠组织病理损伤;地榆皂苷Ⅱ、紫丁香苷和具栖冬青苷能降低急性UC小鼠全血中的中性粒细胞,保护结肠上的酸性黏液层,上调黏膜屏障蛋白ZO-1、Claudin-1和Occludin表达,发挥对急性UC的治疗作用。当地榆皂苷Ⅱ、紫丁香苷和具栖冬青苷合用时,在改善急性UC小鼠的病理症状、结肠炎症反应和肠道黏膜损伤方面的效果与救必应基本等效。转录组测序发现,救必应及其功效成分组合物能调节 cytokine-cytokine receptor interaction、cell adhesion molecules 和PI3K-Akt signalingpathway等信号通路,通过与临床UC患者的差异基因比较及PCR验证,发现救必应及其功效成分组合物均能下调细胞因子OSM、CXCL1、IL6、CXCL13、IL1R1、OSMR和TNFRSF9的mRNA表达。此外,H＆E染色表明,救必应及其功效成分组合物给药7天,UC小鼠的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏和大脑组织均未见明显病理损伤。研究结论救必应能通过抑制炎症反应和改善肠道黏膜屏障损伤发挥对急、慢性UC小鼠的治疗作用,其发挥主要功效的成分是地榆皂苷Ⅱ、紫丁香苷和具栖冬青苷,并且当三者组合使用时,对急性UC小鼠的治疗作用与救必应基本等效。救必应及其功效成分组合物治疗UC的作用机制与其调节cytokine-cytokine receptor interaction信号通路有关。