论文部分内容阅读
第一部分 人羊膜上皮细胞培养及外泌体的提取和鉴定目的:培养人羊膜上皮细胞,从其条件上清内抽提出外泌体并鉴定。方法:我们培养外购的人羊膜上皮细胞,采用外泌体快速提取试剂盒从细胞上清液中提取外泌体,检测外泌体的浓度。通过透射电镜和流式细胞仪检测形态和粒径及表面标志物从而鉴定外泌体。结果:一个T75培养瓶的上清可抽提300μg左右外泌体。透射电镜下看到圆形或椭圆形,大小不一的有脂质膜结构的囊状小泡。粒径检测示其平均粒径(128.5±8.2 nm)及粒径主峰(136.2±1.7nm)均在外泌体的粒径范围内,鉴定外泌体表面上的标记分子 CD63 阳性率 86.2± 1.4(%),CD81 阳性率 94.9±1.1(%)。结论:使用外泌体提取试剂盒能成功抽提外泌体,且透射电镜,粒径检测及表面标记分子检测结果均显示抽提物的特征与外泌体相符。第二部分 人羊膜上皮细胞及外泌体对大鼠急性心肌梗死后心脏结构和功能的影响目的:观察人羊膜上皮细胞及其外泌体治疗大鼠急性心梗的疗效。方法:1.构建SD大鼠心梗模型,随机分为三组:人羊膜上皮细胞治疗组;外泌体治疗组;空白对照组。2.于结扎前后行心电图检查;术前、术后7天、14天及28天分别行经胸超声心动图检查,检查心功能变化。3.术后7天取各组组织制备冰冻切片观察人羊膜上皮细胞及外泌体在心脏内分布情况;术后28天取各组组织制备冰冻切片,行Masson染色,观察心脏纤维化情况。结果:1.结扎前后大鼠心电图出现典型的ST段动态改变。2.心超示术后7、14、28天对照组EF以及FS显著低于治疗组(P<0.0001)。术后14、28天对照组的LVEDD,LVESD较治疗组明显增厚(P<0.05)。3.术后7天,人羊膜上皮细胞及外泌体散在分布于心肌组织间;术后28天,Masson染色示与治疗组相比,对照组的组织纤维化面积更大,组间差异显著(P<0.0001)。结论:人羊膜上皮细胞及其外泌体能够改善大鼠心肌梗死后心功能,并减少心梗后组织纤维化。第三部分 羊膜上皮细胞及外泌体改善大鼠急性心肌梗死后心功能的机制探索目的:初步探索人羊膜上皮细胞及其外泌体改善大鼠心梗后心功能的机制。方法:1.将人羊膜上皮细胞及其外泌体分别与人类脐静脉内皮细胞共培养,不干预组为空白对照组,观察人脐静脉内皮细胞株在Matrigel胶中的成管能力。2.将人羊膜上皮细胞及其外泌体分别与心肌细胞株(H9C2)共培养,不干预组空白对照,缺氧5小时后使用流式细胞仪通过AnnexinV-FITC/PI法检测心肌细胞的凋亡率。结果:1.与人羊膜上皮细胞及外泌体共培养后,内皮细胞的成管能力明显增强,优于对照组(P<0.0001)。2.与人羊膜上皮细胞及外泌体共培养后,心肌细胞的早期凋亡率明显下降,优于对照组(P<0.0001)。结论:人羊膜上皮细胞及其外泌体可以促进血管新生和抑制心肌细胞凋亡;这可能是其改善大鼠心肌梗死后心功能的机制之一。