【摘 要】
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目的:MicroRNA（微小RNA,miRNA）是一类长度为18-25个核苷酸的内源性非编码RNA分子,在许多生物功能中有着重要的作用。越来越多的研究发现,miRNA的失调与许多疾病特别是癌症密切相干。例如,miRNA-141在前列腺癌中异常表达,而miRNA-21在乳腺癌、胰腺癌和肝癌中普遍过度表达。因此,准确检测miRNA对临床诊断和发病机制的研究具有重要的意义。然而由于miRNA丰度低以及家
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目的:MicroRNA（微小RNA,miRNA）是一类长度为18-25个核苷酸的内源性非编码RNA分子,在许多生物功能中有着重要的作用。越来越多的研究发现,miRNA的失调与许多疾病特别是癌症密切相干。例如,miRNA-141在前列腺癌中异常表达,而miRNA-21在乳腺癌、胰腺癌和肝癌中普遍过度表达。因此,准确检测miRNA对临床诊断和发病机制的研究具有重要的意义。然而由于miRNA丰度低以及家族成员之间的序列相似性,目前对miRNA进行敏感、选择性检测仍存在很大挑战,因此开发简单、灵敏且特异的miRNA分析平台十分必要。本研究结合指数扩增反应（EXPAR）和内切酶驱动的三维双足DNA步行机器策略构建了一种集成荧光生物传感器,可实现对miRNA-21的灵敏检测。同时,我们的方法在与双足DNA步行器相关的生物传感器应用上具有巨大的潜力。方法:1.集成荧光生物传感器的构建:基于聚合酶和内切酶的指数扩增反应触发的三维双足DNA步行机器构建一种灵敏的荧光生物传感器。运用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳、实时荧光定量PCR检测系统、荧光分光光度计等方法技术对EXPAR反应和DNA步行器酶促切割反应进行验证。2.分析三维DNA步行器结合EXPAR策略的可行性以及实验条件的优化:用荧光显微镜和荧光分光光度计验证集成生物传感器的可行性;优化DNA模板链的长度、EXPAR反应时间、Nb.Bbv CI内切酶介导的DNA步行器的反应时间、KF聚合酶浓度和Nb.Bbv CI内切酶浓度等实验条件。3.生物传感器的分析性能评价及实际样本分析:评估该检测系统的分析性能,如线性范围、最低检测限、特异性和重复性;分析其在复杂的生物基质中的检测能力。结果:1.用多种实验方法对EXPAR触发的三维DNA步行器策略构建的荧光生物传感器进行验证,结果表明该反应系统可以实现目标分子的特异性识别和扩增。2.基于EXPAR的三维DNA步行器传感器的分析性能和实际样本分析:可以对目标分子miRNA-21特异性识别和灵敏检测;线性范围在10 f M-5 n M;检测限为5.2 f M;反应时间约为70分钟;可以区分miRNA-21和其它同源miRNA;进行五次独立试验重复性较好;在十倍稀释人类血清中仍然保持较好的检测水平;本方案与现有的荧光核酸检测方法进行了比较,具有较大的优势。结论:本研究设计了一种基于指数扩增反应和切口内切酶驱动的三维双足DNA步行器策略的荧光生物传感器。该传感器用于miRNA灵敏和特异性检测。靶miRNA在聚合酶和内切酶的作用下首先启动EXPAR,在溶液中产生大量的双足DNA步行器。新生成的DNA步行器可以连续组装在荧光标记的聚苯乙烯微球轨道上。在内切酶存在的情况下,DNA步行机器被激活,离心分离后,上清液中产生增强的荧光信号。溶液中酶辅助的EXPAR与粒子上酶驱动的DNA步行器相结合,显著提高了信号放大效率,增强了检测灵敏度。因此,我们的方法在双足DNA步行器相关生物传感器的应用上具有巨大的潜力。
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