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目的/背景：丙型肝炎病毒(HCV)感染可导致肝硬化和肝癌，是危害生命健康的感染性疾病。药物治疗既昂贵又容易造成严重不良反应。因HCVRNA病毒抗原变异性大，因此研制可预防并清除病毒的强而有效的多种表位特异性的新型免疫疫苗具有重要的临床意义。大量研究事实显示以腺病毒为载体基因修饰树突状细胞是免疫治疗领域极有前景的新型疫苗。该疫苗可在肿瘤和感染性疾病模型诱导抗原特异性体液及细胞免疫应答。树突状细胞可由腺病毒或活化因子激活成熟，表达MHCⅡ类分子和共刺激分子，促进IL-12分泌，作用于效应细胞诱导T细胞向Th1亚型转化。HCV非结构蛋白NS3区氨基酸序列高度保守，NS3特异性T辅助性细胞应答与急性感染后的病毒清除密切相关，此种反应的缺失会导致病毒的持续存在及慢性肝炎。最近的研究发现，体内接种表达HCV核心抗原E1的树突状细胞所诱导的CD4+andCD8+T细胞应答弱于表达NS3抗原的树突状细胞应答反应。而且研究事实表明，无论NS3DNA或表达NS3的重组腺病毒疫苗均可激发较强的体液免疫和细胞免疫应答。本课题组研究发现多肽或蛋白冲击的树突状细胞也可诱导有效的细胞和体液免疫反应。然而迄今未见对腺病毒转导树突状细胞体内诱导丙型肝炎病毒非结构蛋白NS3特异性细胞及体液免疫反应的报道。因此本研究将构建树突状细胞基因转导疫苗，采用初次/加强免疫接种法，在HLA-A2.1转基因和Babl/c两种小鼠动物体内研究并比较树突状细胞介导的HCVNS3基因疫苗和蛋白冲击疫苗的免疫作用，通过检测抗NS3IgG，IgG1、IgG2a抗体，NS3特异性IFN-γ分泌型T细胞反应，以及T细胞因子水平，确定最佳免疫疫苗，免疫治疗方式和途径。
方法：
1、编码HCVNS3基因重组腺病毒(AdNS3)的构建。HCVH77株NS3片段PCR克隆至pcDNA3.1/V5-His-Topo载体，并在HindⅢ/XbaⅠ限制性酶切位点亚克隆至pAdTrackCMV转移载体。仅表达绿色荧光蛋白的腺病毒(AdGFP)为阴性对照组。293细胞扩增病毒，氯化铯密度梯度超速离心法及薄膜透析纯化病毒。
2、重组腺病毒滴度和基因鉴定及蛋白表达空斑形成实验检测病毒滴度，PCR扩增，凝胶电泳检测目的基因，WESTERNBLOT法测定蛋白表达。
3、分离培养小鼠骨髓树突状细胞从小鼠胫骨分离提取骨髓，细胞悬液静置12小时后，分离贴壁细胞，加入GM-CSF和IL-4继续培养7天，显微镜下观察到树突状细胞形态变化。
4、编码HCVNS3或GFP蛋白的重组腺病毒转导树突状细胞。以感染率(MOI)100(3×108pfu/106DC/孔)的腺病毒感染培养7天的树突状细胞。一小时后，加入E.coli-LPS及完全营养液调节DC终浓度至1×106～2×106cells/ml。48h后收获细胞，清洗除去病毒残液以备注射用。另设蛋白对照组(DC-rNS3)，即将纯化重组HCVNS3蛋白与DC共育，于37℃二氧化碳培养箱培养4h，注射前洗涤并收集细胞，同量免疫接种备用。
5、FACS和WESTERNBLOT方法检测树突状细胞表面抗原及细胞蛋白表达率。2×105细胞在4℃条件下分别与含0.5％小牛血清(BSA)PBS稀释的FITC标记的抗CD11c抗体、PE标记的抗CD86和抗MHCclassⅡ(I-Ad)抗体共育30min。洗涤后于FACStar流式细胞仪，CellQuest软件分析测定细胞表面抗原。NS3蛋白表达或转导效率采用WESTERNBLOT方法测定。12％SDS-PAGE凝胶电泳分离细胞裂解液中的可溶性蛋白，硝酸纤维膜转印后，以兔抗小鼠NS3多克隆抗体测定。
6、免疫接种。采用腹腔注射方式分别于两种雌性动物体内免疫接种(初次/加强)基因修饰树突状细胞(3×105)两次，每次间隔10天。末次接种10日后，处死小鼠。取脾脏供细胞免疫分析用。收集血清测定抗原特异性抗体分析。
7、抗体分析。采用酶联免疫检测法测定体液免疫应答。重组NS3或病毒衣壳包被96孔板，除去非特异性结合后，与1/50稀释的鼠血清共育1h。辣根过氧化物酶偶联羊抗鼠IgG，IgG1或IgG2a抗体(1/2000)检测NS3或腺病毒特异性抗体。
8、斑点酶联免疫检测法测定分泌IFN-γT细胞增殖反应。系列稀释的脾淋巴细胞悬液复孔置入包被抗IFN-γ抗体的96孔板.在100μlrNS3或ConA作用下，48小时后，加入生物素亲和IFN-γ检测抗体，及碱性磷酸酶偶联streptavidin，以TNBT为底物，于解剖显微镜计数斑点形成数。
9、酶联免疫法测定脾淋巴细胞T辅助细胞因子分泌。分别以rNS3(0.1μg/ml)，ConA(1μg/ml)或RPMI营养液作为刺激剂活化每孔1×106的脾淋巴细胞，48小时后采用IFN-γ，IL-4，IL-2，IL-10检测试剂盒测定细胞因子分泌水平。
结果：
1、重组腺病毒转导树突状细胞。AdNS3转导293及DC均可检测到约～70kDa处蛋白条带。腺病毒转染的基因可在DC细胞内高效表达HCVNS3蛋白。且70％的DC感染MOI100的AdNS3显示绿色荧光且无明显细胞病理改变。骨髓细胞经培养，7天后，90％细胞表面抗原为CD11c阳性，即为树突状细胞。此类细胞感染并与活化因子LPS继续共育2天后，经流式细胞仪检测，CD86andI-AdclassⅡ分子表达明显增加。提示腺病毒可促进DC成熟。蛋白冲击DC仍可得同样的结果。
2、重组腺病毒转导树突状细胞转基因疫苗体内免疫活性测定。两种系小鼠两次接种DC-AdNS3均产生明显升高的抗NS3IgG抗体，并以IgG2a亚型为主。在HLA-A2.1转基因小鼠组，DC-AdNS3免疫接种后，与DC-AdGFP相比，NS3抗原(0.1μg/ml)诱导的IFN-γ分泌型T细胞反应与也显著增强(p＜0.01)。DC-rNS3加强接种后能产生明显升高的T细胞应答(p＜0.05)。相比之下，于Babl/c小鼠体内采用相同途径接种免疫疫苗后，仅DC-AdNS3组可观察到明显升高的T细胞反应(p＜0.05)。细胞因子检测结果显示，Babl/c小鼠加强接种10天后，DC-AdNS3组T细胞悬液内可测得高水平的IL-2，IFN-γ(p＜0.01)以及显著降低的IL-10分泌水平(p＜0.05)。DC-rNS3免疫动物后，IL-2，IFN-γ分泌适度增加(p＜0.05)，IL-10微弱下降(p＞0.05)。在HLA-A2.1小鼠实验中也得出相同的实验结果。即IL-2、IFN-γ明显上升，IL-10显著降低。
结论：腺病毒转染DC可有效表达目的基因抗原，且与DC成熟因子LPS可共同刺激DC成熟而不影响其表型。DC-AdNS3以初次/加强方式免疫接种两种系小鼠均能诱导明显的体液及细胞免疫反应，即抗原特异性IgG抗体形成，其中IgG2a抗体亚型高于IgG1，同时刺激分泌IFN-γ的T细胞增殖应答，促进NS3特异性Th1细胞因子IL-2，IFN-γ的产生等。以腺病毒为载体基因转导树突状细胞的免疫作用强于蛋白冲击树突状细胞。IgG2a与IgG1比例的升高，IFN-γ，IL-2Th1细胞因子明显强于IL-4和IL-10等Th2细胞因子的分泌等相关指标，进一步支持腺病毒转染树突状细胞表达HCVNS3疫苗的Th1应答的免疫促进作用。本研究首次以腺病毒为载体基因修饰树突状细胞表达HCV非结构蛋白NS3，在具有人HLA-A2.1背景的转基因小鼠体内研究其增强体液免疫应答及促进Th1细胞免疫作用，研究结果对HCV临床预防及治疗提供重要的参考价值。