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研究目的:髓系抑制细胞(myeloid-derived suppressor cells,MDSC)是骨髓来源、具有免疫抑制功能的非成熟髓系前体细胞。近年来动物实验研究发现MDSC在多种自身免疫疾病小鼠模型体内大量聚集并参与炎症免疫应答,但其作用尚存争议。在自身免疫疾病小鼠模型中,尽管一部分研究认为MDSC可以通过抑制T细胞的功能缓解疾病的进展,但仍有研究认为MDSC有促炎作用,可以促进疾病的进展。而MDSC在自身免疫疾病患者中的作用与机制研究较少,尚不明确。为解决这一问题,本课题以系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus,SLE)患者为研究对象,通过对SLE患者免疫细胞变化、结合体外细胞实验及人源化小鼠的研究,进一步阐释在SLE中MDSC对Th17细胞分化及疾病进展的作用及其机制。研究方法:(1)利用流式细胞分析法(flow cytometry,FCM)测定SLE患者及健康对照组(healthy control,HC)中HLADR-CD11b+CD33+MDSC及其亚群(CD14+CD66b-单核细胞亚型和CD14-CD66b+粒细胞亚型)的比例与数目,并分析其与系统性红斑狼疮疾病活动指数(systemic lupus erythematosus disease activity index,SLEDAI)的相关性;流式分选MDSC及其亚群,通过HE染色比较SLE及HC来源的MDSC形态异同。(2)利用FCM及酶联免疫吸附测定法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)法测定SLE患者及HC中的Th17细胞比例及相关细胞因子(IL-17A、IL-17F)水平;免疫荧光染色法(immunofluorescence,IF)观察SLE患者肾组织中肾小球IL-17A、IL-17F的沉积情况;苏木精-伊红染色(hematoxylin-eosin staining,HE)及过碘酸雪夫氏(periodic acid-Schiff stain,PAS)染色观察SLE病变肾组织病理改变;(3)测定血清精氨酸酶1(arginase-1,Arg-1)酶活性,并比较SLE患者及HC血清中Arg-1活性变化;利用FCM和IF方法检测MDSC中Arg-1表达,比较SLE患者与HC来源的MDSC及其亚群表达Arg-1的异同;分析SLE患者中MDSC比例、Arg-1活性、IL-17之间的相关性;ELISA法测定SLE患者血清IL-6表达;MDSC培养体系加入IL-6或IL-17因子,利用实时荧光定量核酸扩增技术(Real-time Quantitative PCR,q RT-PCR)观察IL-6或IL-17对MDSC中Arg-1 m RNA表达的影响。(4)在体外Th17诱导体系内培养幼稚CD4+T细胞,加入MDSC和(或)Arg-1抑制剂,通过FCM、ELISA法比较CD4+IL-17A/IL-17F+(Th17)细胞及一般性调控阻遏蛋白激酶2(general control non-depressible 2,GCN2)、磷酸化的真核起始因2α亚基(eukaryotic initiation factor 2α,EIF2α)、雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,m TOR)和维甲酸相关孤核受体γt(retinoic acid-related orphan receptorγt,RORγt)等相关信号分子改变,确定MDSC的促Th17分化作用及其分子机制。(5)将SLE患者来源的PBMC转输至免疫缺陷的非肥胖糖尿病/重症联合免疫缺陷(nonobese diabetic/severe combined immunodeficient,NOD/SCID)小鼠中构建人源化SLE小鼠模型,给予Arg-1抑制剂或去除MDSC治疗,通过ELISA法检测小鼠尿蛋白及血清人源抗ds DNA抗体水平、q RT-PCR检测脾和肾组织内人IL-17 A m RNA表达等变化;同时通过IF染色检测肾组织内人IL-17、人免疫球蛋白G(immunoglobulin G,Ig G)沉积的变化及PAS染色观察肾脏病理改变,确定MDSC及其产生的Arg-1在体内促Th17及SLE疾病进展的作用。研究结果:(1)与HC相比,SLE患者外周血中MDSC及其亚型的比例与数目均显著增加,并与SLEDAI、血清IL-17A水平均呈正相关;SLE来源的MDSC与HC来源的MDSC在形态上无明显差别。(2)SLE患者中外周血中Th17细胞及血清IL-17A和IL-17F水平明显高于HC,病变肾组织中可见IL-17A和IL-17F沿肾小球毛细血管壁沉积。(3)MDSC可产生Arg-1,SLE来源的MDSC产生的Arg-1水平较HC增高,并以粒细胞亚型产生为主;同时SLE患者血清中Arg-1活性较HC增强,并与SLEDAI、MDSC比例、IL-17A正相关;SLE患者血清IL-6水平较HC显著增高,体外实验中IL-6可促进MDSC中Arg-1 m RNA表达的增高,而IL-17对MDSC中Arg-1 m RNA表达没有影响。(4)体外Th17极化实验中,MDSC显著促进Th17细胞的分化,SLE患者来源的MDSC较HC来源的MDSC促Th17分化能力更强,MDSC的促Th17分化作用依赖于Arg-1;MDSC可上调CD4+T细胞内GCN2、磷酸化e IF2α、m TOR和RORγt的表达,加入Arg-1抑制剂可抑制上述分子的表达,提示MDSC促Th17分化作用与Arg-1下游GCN2-e IF2α、m TOR信号通路与转录因子RORγt相互作用有关。(5)转输SLE患者的PBMC给NOD/SCID小鼠可以建立人源化SLE小鼠,该小鼠尿蛋白水平与转输细胞的患者疾病严重程度呈正相关,患病小鼠血清中有人源抗ds DNA抗体、脾及肾内人有IL-17A m RNA的表达,肾组织内有人Ig G沉积;给予Arg-1抑制剂或去除MDSC治疗显著降低人源化SLE小鼠中尿蛋白及血清人源抗ds DNA抗体水平,减少脾和肾组织内人IL-17 m RNA水平及肾组织中人IL-17A和人Ig G沉积,提示MDSC及其产生的Arg-1是导致Th17反应和相关肾损伤的关键因素。研究结论:我们的研究为MDSC在人系统性红斑狼疮中的致病作用提供了直接证据,并部分阐明MDSC通过分泌Arg-1促进Th17分化及自身免疫发展的分子机制,提示MDSC或Arg-1可能作为治疗系统性红斑狼疮及其他Th17细胞介导的自身免疫疾病的新靶点。