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研究背景:髓系抑制细胞(Myeloid-derived suppressor cells,MDSC)是一群在肿瘤、炎症、感染和自身免疫病中发挥免疫抑制功能,具有异质性的未成熟髓系细胞。近年来,由于MDSC和辅助性T细胞17(T helper cell 17,Th17)常共存于某一相同的病理条件而被广泛研究。我们前期在系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus,SLE)患者及人源化小鼠模型的体内外实验中均证明MDSC可以通过产生精氨酸酶-1(arginise-1,Arg-1)分解精氨酸(arginine,Arg)促进Th17分化,加重疾病进展。但Arg分解后的哪一步代谢产物促进了Th17分化尚不明确。研究目的:本研究以人和鼠的Th17为研究靶点,探讨MDSC的下游代谢产物与Th17分化的关系,并通过体外诱导、临床SLE患者样本及人源化SLE小鼠实验证明MDSC促Th17分化及其与SLE疾病进展关系的免疫代谢途径及分子机制。研究方法:1.使用前列腺癌细胞系RM-1皮下接种无特定病原体(Specific Pathogen Free,SPF)级C57BL/6雄性小鼠,磁珠分选非荷瘤小鼠幼稚CD4+T细胞,流式分选荷瘤小鼠MDSC;采集人脐带血分离单个核细胞(cord blood mononuclear cells,CBMC),磁珠分选幼稚CD4+T细胞,流式分选MDSC。在鼠或人Th17分化条件下分为单独培养、+Orn、+MDSC、+MDSC+DFMO(二氟甲基鸟氨酸,difuloromethylornithine)和+DFMO共培养5组,使用流式细胞术(flow cytometer,FCM)检测CD4~+IL-17A~+细胞及CD4~+RORγt~+细胞比例,酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测培养上清中IL-17A浓度,实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qPCR)检测IL-17a及RORγt的mRNA表达水平。2.将幼稚CD4+T细胞向Th17诱导分化的条件下,分为单独培养组、加入MDSC共培养及加入MDSC和nor-NOHA(Arg-1抑制剂)3组,做RNA芯片分析,检测差异表达的miRNA(miR-542-5p)。将鼠或人Th17分化条件下分为单独培养幼稚CD4~+T细胞、+Orn、+MDSC、+MDSC+DFMO和+DFMO共培养5组细胞,培养结束后纯化RNA,qPCR验证miR-542-5p的差异表达。接下来,对幼稚CD4+T细胞过表达或沉默miR-542-5p后,向Th17诱导分化。使用FCM检测CD4~+IL-17A~+细胞及CD4~+RORγt~+细胞比例,qPCR检测IL-17a及RORγt的mRNA表达水平。由于TFGβ/SMAD通路是Th17分化的重要通路,我们通过生物信息学检索寻找该通路中可miR-542-5p结合的关键基因,再使用荧光素酶报告实验检测miR-542-5p与关键基因转录活性的关系。miR-542-5p转染后、转染并向Th17分化2种条件下分别qPCR检测SMAD3、SMAD7、SMURF1的mRNA表达水平,利用FCM检测SMURF1、总SMAD2/3及pSMAD2/3表达水平。3.检测SLE患者外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMC)中多胺合成酶及mi R-542-5p表达水平,并与SLE疾病活动度评分做相关性分析。4.通过转输SLE患者的PBMC给非肥胖糖尿病/重症联合免疫缺陷IL-2受体γ链敲除(NOD/SCIDIL-2Rγnull,NSG)小鼠构建人源化SLE小鼠。1周后再给予对照或过表达miR-542-5p体内转染,4～5周后FCM检测小鼠PBMC、脾细胞中CD4~+IL-17A~+细胞及CD4~+RORγt~+细胞比例,qPCR检测il-17a、rorγt及多胺合成酶的mRNA在脾和肾脏中的表达水平。研究结果:1.体外Th17极化实验中,加入MDSC或Orn与对照组相比均可以在mRNA及蛋白水平上促进小鼠和人幼稚CD4+T细胞IL-17A及RORγt表达;如果同时加入DFMO和MDSC,抑制MDSC代谢产物Orn进一步分解,则无促进作用。2.MDSC促进小鼠和人幼稚CD4~+T细胞向Th17分化的同时,ODC1、SRM、SMS 3种多胺合成酶表达增多,也就是说是MDSC分解Arg产生的代谢终产物多胺促进Th17分化。3.人Th17体外分化体系下,mi R-542-5p的表达在加MDSC组明显高于对照组,而加MDSC同时加入Arg-1抑制剂则较只加MDSC组显著降低miR-542-5p表达水平。4.人及小鼠Th17体外分化体系下,加入Orn及MDSC组miR-542-5p表达显著高于对照组,加MDSC+DFMO组miR-542-5p表达显著低于只加MDSC组。人Th17体外分化体系下,加入3种多胺后miR-542-5p表达均显著高于对照组。5.人幼稚CD4+T细胞,过表达或沉默miR-542-5p后,再加入Th17体外诱导体系,在基因及蛋白水平上IL-17A及RORγt的表达均与miR-542-5p的表达水平一致。6.幼稚CD4+T细胞过表达miR-542-5p后,在幼稚及Th17状态下,均可降低SMURF1的基因及蛋白表达,促进SMAD2/3复合体磷酸化,正调控TGF-β/SMAD通路,沉默miR-542-5p则负调控TGF-β/SMAD通路。7.SLE患者PBMC中3种多胺合成酶与mi R-542-5p的表达正相关。8.SLE患者PBMC中3种多胺合成酶与miR-542-5p的表达均高于健康对照组,并与SLE患者疾病的严重程度正相关。9.转输SLE患者的PBMC给NSG小鼠构建人源化SLE小鼠,去除MDSC可减少人源化SLE小鼠PBMC、脾及肾脏中人源Th17比例,下调脾及肾脏中3种多胺合成酶、miR-542-5p、IL-17A及ROR?t表达。10.人源化SLE小鼠体内过表达miR-542-5p可在PBMC、脾及肾脏中逆转因去除MDSC导致的人源Th17比例下降以及IL-17A及ROR?t表达下调。结论:本研究在发现MDSC通过多胺/miR-542-5p/TGF-β通路促进Th17体外分化的基础上,通过临床SLE患者样本检测确定Arg-1/多胺/miR-542-5p与疾病进展正相关,并利用人源化SLE小鼠模型在体内验证了MDSC通过多胺/miR-542-5p促进Th17分化。这一发现不仅从理论上对MDSC在SLE中增多且加重疾病的临床现象给出了新的解释,也为临床治疗SLE提供了新的思路及干预靶点。