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小桐子(Jatropha curcas.L)是多年生的木本植物,因其种子含油量高且可用于生物柴油和生物航油的制备,所以被视为一种重要的生物能源植物在近年来备受关注。而要成为理想的能源植物,小桐子在种子产量、油成分、抗逆境胁迫等方面还有待改进。目前,转基因育种的迅速发展可为小桐子的性状改良提供一条便捷的途径,尤其是小桐子的遗传转化体系已基本建立。在转基因育种中,启动子是外源基因在植物体内有效表达的一个重要调控因子。 本研究通过基因步移的方法从小桐子中分别克隆了3个组成型表达基因的启动子、3个花特异性表达基因的启动子以及1个种子特异性表达基因的启动子。然后将这些启动子与GUS报告基因构建表达载体,通过农杆菌介导分别转入小桐子和拟南芥中进行表达。通过对GUS表达的检测分析,从而对各个启动子的表达活性进行鉴定。 组成型表达的启动子包括来自泛素蛋白ubiquitin extension protein基因的1.2kb JcUEP启动子、polyubiquitin基因的2.3 kb JcUBI启动子以及肌动蛋白actin基因的1.1 kb JcACT启动子。GUS组织染色结果显示,JcUEP启动子在拟南芥和小桐子的各个组织部位均有表达活性,而JcUBI启动子在拟南芥的花序芽和雌蕊以及小桐子的花序芽、雌花和授粉后12天的果中几乎没有活性。通过GUS荧光活性定量检测对JcUEP、JcUBI和CaMV35S启动子在小桐子中的活性进行比较分析,结果显示尽管CaMV35S启动子在小桐子多个组织部位中的活性要高于JcUEP启动子,但JcUEP启动子能够使外源基因在小桐子中表达更加均一。JcUB启动子在各个组织部位的活性均比JcUEP启动子低。另外,JcUEP启动子还能在逆境条件下使基因的表达维持原有水平。而JcACT启动子在拟南芥和小桐子中均没有表达活性。 花特异性表达基因的启动子包括APETALA1基因的1.5 kb JcAP1启动子、TOMATO MADS BOX GENE6基因的1.8 kb JcTM6启动子和LEAFY基因的2.4kbJcLFY启动子。JcAP1基因在小桐子花序芽和花中特异表达,其启动子在拟南芥的花序芽和花粉具有表达活性,但在小桐子中,除了花序芽外还在种子中有较高的活性,因而本实验所克隆的JcAP1启动子在小桐子中不是一个花特异性表达的启动子。JcTM6基因主要在小桐子的花中表达,其启动子在拟南芥的雄蕊中有很强的活性,在萼片中也有一定的活性。在小桐子中,JcTM6启动子在雌花包括花瓣和雌蕊中表达活性远远高于其他组织部位,因而该启动子是一个小桐子雌花特异性表达启动子。JcLFY基因主要在花序芽中表达,而其启动子在拟南芥花芽以及其他组织部位中均无表达活性。当将其缺失为1.8kb大小时,该启动子在花药中显现出表达活性,说明JcLFY启动子在花药中的活性受到1.8 kb上游的调控元件的抑制。 JcMFT1在小桐子中种子中特异表达,其1.5 kb启动子在拟南芥植株的种子中能特异表达,尤其在种子发育的中后期活性很高,且在胚和胚乳中均有表达活性。在种子萌发过程中,JcMFT1启动子活性受ABA诱导。此外,该启动子在发育早期的幼苗中也有活性,但会随着幼苗的生长而逐渐消失。JcMFT1启动子在拟南芥中的表达模式与JcMFT1基因在小桐子中的表达模式几乎一致。