论文部分内容阅读
研究背景和目的:自身免疫性肝炎（autoimmune hepatitis,AIH）是一种免疫介导的肝损伤,其肝脏炎症多呈慢性进行性,在欧美国家更为多见,我国AIH发病率尚无具体统计数据,但近年报道的病例数量显著增多。AIH发病机制尚未完全阐明,相关领域基础研究相对较少,缺乏理想的动物模型是不可忽视的原因之一。AIH的早期临床诊断困难,高度依赖肝脏穿刺,早期诊断和治疗与疾病预后极为相关。使用免疫抑制剂是目前临床上治疗此类疾病的主要方法,但患者病程迁延反复,停药复发,及治疗过程中药物的毒副作用在临床上不可避免。因此深入研究AIH的发病机制,寻找临床诊断辅助标志物,以及探索潜在的干预靶点是如今亟待解决的问题。1992年,Tiegs等首次利用刀豆蛋白A（concanavalin A,ConA）在小鼠中成功建立了T细胞依赖的肝损伤动物模型。但此模型是一个急性肝损伤模型,小鼠肝炎在48小时后逐渐缓解,小鼠血清未能出现自身抗体,肝脏未出现进行性加重的纤维化,故其并不能模拟人体内AIH的慢性过程,目前国内外尚无理想的慢性动物模型。因此,建立一个能够在动物体内完整呈现类似AIH的慢性进行性肝脏炎症发生过程的模型,是首当其冲需要解决的关键问题。近年来,调节性T细胞（Regulatory T cells,Tregs）和辅助性T细胞17（T helper cell 17,Th17）的平衡紊乱被认为是很多自身免疫性疾病的重要致病机制。提升Treg/Th17的比例也作为治疗多种自身免疫性疾病的重要潜在干预手段。但其在AIH中的作用并不清楚。Th17主要分泌炎性细胞因子IL-17,有报道显示AIH患者外周血和肝脏组织中IL-17显著升高,可进一步加重肝脏炎症损伤。而Treg细胞可分泌多种抑炎细胞因子,能有效抑制Th17的增殖和活性。但Treg和Th17在AIH中具体功能和平衡变化尚未研究清楚,其主要原因之一是缺乏合适的动物模型。近年来越来越多的证据显示,泛素化在多种自身免疫性疾病中发挥关键作用。泛素结合酶E2O（ubiquitin-conjugating enzyme E2O,UBE2O）是一种新型泛素酶,有研究显示,UBE2O兼有泛素结合酶E2和泛素连接酶E3的功能,并在不同情况下发挥不同作用,而目前对于其具体功能知之甚少。最新研究发现,UBE2O在巨噬细胞中可以通过泛素化关键炎性转录因子,抑制炎症因子的分泌,但其在AIH发病机制中尚无研究。于是我们猜想,UBE2O是否能够通过调控AIH肝脏中Treg和Th17的分化,提高Treg的比例,从而缓解肝脏炎症。为了验证这一假设,我们利用新型CYP2D6-AIH小鼠模型,在其体内过表达UBE2O,并观测了小鼠肝脏炎症和纤维化的进展情况。我们进一步检测了小鼠肝脏Treg/Th17的比例变化,并探索了相关机制。在本课题的研究中,我们建立了新型CYP2D6-AIH小鼠模型,对于AIH研究领域提供了研究工具。此外,我们筛选了血清生物学标志物,对于AIH的临床诊断提供了线索。本课题同时也探讨了UBE2O对于AIH的保护作用,或可为进一步阐明AIH的发生发展机制,并探索临床AIH的治疗手段提供新思路和理论依据。方法:（1）通过给小鼠尾静脉注射腺病毒诱发一过性肝脏急性炎症损伤,随后每三天一次尾静脉高压注射一次人细胞色素P450 2D6（cytochrome P450 2D6,CYP2D6）抗原过表达质粒载体,使之在肝脏持续过表达,以建立CYP2D6-AIH小鼠模型。（2）肝脏组织H＆E染色评估小鼠肝脏炎症程度改变。（3）天狼猩红、α-SMA染色检测纤维化情况。（4）免疫荧光和ELISA检测法检测模型鼠自身抗体产生和CD4+T、CD8+T细胞浸润程度。（5）H＆E染色、CBA多种炎性因子检测,以及流式细胞术对比分析CYP2D6-AIH模型鼠和急性肝损伤ConA模型的特征。（6）采集CYP2D6-AIH小鼠血清,通过蛋白质质谱检测技术筛选差异性蛋白,并进行KEGG、GO富集分析及显著差异蛋白的AIH临床标本验证。（7）通过Western blot、RT-PCR、免疫组化检测UBE2O在AIH小鼠肝脏中的表达情况。（8）在AIH小鼠肝脏过表达UBE2O观察肝脏炎症、纤维化以及相关炎性因子的改变情况。（9）流式细胞术检测UBE2O对于肝脏内Treg和Th17比例的调控作用。（10）通过肝细胞L02转染UBE2O并进行上清分泌型蛋白检测,探索UBE2O调控肝细胞分泌IL-6,从而影响Treg、Th17分化的机制。结果:第一部分:成功建立符合AIH病理特征,可以模拟人体AIH发生发展过程的小鼠模型。随后将其与急性肝损伤ConA模型进行炎症因子、肝脏炎症发展过程及Treg/Th17平衡动态变化的对比分析,结果如下:（1）高压尾静脉注射成功在肝脏中过表达CYP2D6;（2）CYP2D6-AIH小鼠第4周体内出现自身抗体;（3）第4周可以观察到CYP2D6-AIH小鼠肝脏切片,H＆E染色可见界面性慢性炎症、玫瑰花环、淋巴细胞穿入等类似AIH的特征性病理改变,且炎症进行性加重;（4）第5周时肝脏出现明显纤维化;（5）H＆E染色显示急性ConA模型小鼠肝脏炎症于48小时后逐渐缓解,血清促炎因子如IL-6、IL-17A,抗炎因子IL-10等均升高显著。慢性CYP2D6-AIH模型小鼠血清促炎因子升高,抗炎因子升高不明显。（6）急性ConA模型小鼠肝脏Treg和Th17均升高,于48小时后逐渐下降。而CYP2D6-AIH小鼠模型中Th17升高显著,Treg变化不明显,略有下降。第二部分:为筛选辅助临床AIH诊断的标志物,取CYP2D6-AIH模型小鼠与对照小鼠的血清样本利用同重同位素标记定量（IBT）技术对两组血清样本进行了蛋白质组学定量分析。结果如下:（1）同正常组小鼠血清相比,AIH小鼠血清中发现了176个差异性蛋白（DEPs）,其中148个上调,28个下调。（2）对DEPs进行通路富集分析发现30个显著富集的KEGG信号通路（P<0.05）,最显著的信号通路为代谢相关信号通路。（3）对DEPs进行基因功能注释分析发现,最多的差异性蛋白集中在细胞连接和代谢过程。（4）差异性最显著的蛋白为血清淀粉样蛋白A1（SAA1）,在AIH小鼠血清中升高3倍。（5）取临床确诊AIH患者的血清标本及肝穿标本进行SAA1的表达验证并与病毒性肝炎患者血清SAA1水平进行比较,提示SAA1可能作为AIH的临床辅助诊断指标。第三部分:探讨UBE2O在急性ConA肝损伤模型和慢性AIH模型中的保护作用和对Treg/Th17比例变化的调控。结果如下:（1）WB、RT-PCR、免疫组化显示UBE2O在急性肝损伤ConA模型和AIH模型小鼠肝脏中均表达降低。（2）过表达UBE2O可以缓解ConA小鼠和CYP2D6-AIH小鼠的肝脏炎症损伤。（3）过表达UBE2O可以延缓AIH小鼠的纤维化进展。（4）过表达UBE2O降低AIH和ConA小鼠血清的促炎因子,升高其血清中的抗炎因子水平。（5）AIH小鼠中UBE2O的过表达增加肝脏Treg的数量,降低Th17的数量,从而提升Treg/Th17的比例,诱导免疫耐受。第四部分:探索UBE2O通过泛素化降低肝细胞炎症因子从而影响Treg和Th17分化的机制。结果如下:（1）分离CYP2D6-AIH小鼠和正常小鼠的肝细胞,取其培养上清培养na（?）ve CD4+T细胞,发现Treg分化在CYP2D6-AIH小鼠肝细胞组明显低于正常组,而Th17细胞比例高于正常组。（2）取UBE2O过表达的L02细胞上清与外周血CD4+T细胞共培养,与对照组相比,发现Treg比例增加,Th17比例减少。（3）取UBE2O过表达的L02细胞上清与对照组细胞上清,利用人细胞因子阵列检测试剂盒筛选出肝细胞可分泌相当量的IL-6,其对于Treg和Th17分化起着关键调控作用,且其表达量在UBE2O的过表达后降低。（4）分离CYP2D6-AIH小鼠和正常小鼠的肝细胞培养并加入抗IL-6抗体,取其培养上清培养na（?）ve CD4+T细胞,未见Treg所占比例发现明显变化。结论:本课题的主要研究结论可以总结如下:此新型AIH动物模型可以近似模拟AIH体内的发生发展过程,能够作为AIH基础研究的有效工具。通过血清蛋白质组学信息采集分析发现,代谢过程在AIH发生发展中起着关键作用。SAA1作为最高差异蛋白或可作为临床诊断AIH的特异性标记物。UBE2O通过泛素化降低肝脏IL-6的表达,促使CD4+向Treg分化,降低其向Th17分化,提高Treg/Th17的比例,诱导AIH小鼠肝脏免疫耐受,从而缓解AIH的疾病进程。本研究为AIH的基础研究、临床诊断和干预提供了工具和新思路。