目的:肿瘤干细胞是存在于肿瘤组织中具有自我更新和分化潜能的细胞,是肿瘤形成的起始细胞,维持肿瘤生长,是肿瘤复发转移的根源。通过对肿瘤干细胞的分选鉴定可以使我们能更清晰认识其特征,从而寻找新的方法来治疗肿瘤,提高治愈率。肿瘤干细胞理论认为肿瘤是由肿瘤干细胞异常增殖、分化而形成的,常规治疗仅能消灭增殖期的非致瘤性肿瘤细胞,从而使肿瘤缩小甚至消失,但是当治疗停止后,具有耐药性的肿瘤干细胞再次增殖形成肿瘤,并像“蒲公英”一样到处播散。如果我们能去除乳腺癌干细胞,肿瘤将会永远消退,从而达到根治肿瘤的目的。近年来,免疫治疗正逐渐成为肿瘤综合治疗的研究热点,有望成为肿瘤治疗的又一主要手段。免疫治疗中常用的活性细胞有:淋巴因子激活的杀伤细胞(LAK)、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)和特异性细胞毒T淋巴细胞(CTL)。有报道提出,利用树突状细胞(dendritic cell, DC)的高抗原递呈活性,将乳腺癌细胞抗原肽负载DC,从而激活机体免疫反应,可促进抗瘤效应和特异性。树突状细胞作为唯一的专职抗原递呈细胞(antigen processing cell, APC),处于免疫反应的中心地位。非成熟的DC捕获抗原后被激活成为成熟的DC,其细胞表面表达MHCⅠ类和Ⅱ类分子、共刺激分子B7-1(CD80)和B7-2(CD86)、黏附分子CD54(ICAM-1)和CD50(ICAM-3)等,并将抗原肽递呈给CD4+和CD8+T细胞,诱导其成为特异性细胞毒性T细胞(CTL),分泌细胞因子(如IL-12等),产生Th1型免疫应答而发挥抗肿瘤作用。本研究拟采用流式细胞仪测定乳腺癌MCF-7细胞系中CD55高表达(CD55hig)细胞平均荧光密度值,并分选CD55hig细胞,分析其是否具有肿瘤干细胞特性,并以此来检测原发性乳腺癌组织中乳腺癌干细胞的比例,从而寻找一种从乳腺癌组织中分离肿瘤干细胞的方法;术中摘取乳腺癌患者腋窝淋巴结,从腋窝区域引流淋巴结单个核细胞中,诱导培养DCs和肿瘤抗原特异性CTLs,通过体外杀伤实验,为乳腺癌干细胞的治疗提供新的方法和理论依据。方法:第一部分乳腺癌MCF-7细胞系中CD55hig亚群生物学特性分析培养乳腺癌MCF-7细胞系,加入核酸染料Hoechst33342和Verapami,流式细胞仪检测SP亚群和MP亚群细胞比例,并分离SP亚群和MP亚群细胞,以CD55单克隆抗体标记SP干细胞和MP亚群细胞,测定SP干细胞和MP亚群细胞的CD55平均荧光密度值,再以CD55单克隆抗体标记未分选MCF-7细胞,测定CD55hig细胞所占比例,并分选收集CD55hig细胞,检测其细胞贴壁率、克隆形成率和细胞周期等生物学特性,测定CD55hig细胞是否具备肿瘤干细胞特性。第二部分化学药物及免疫治疗对乳腺癌MCF-7细胞系中CD55hig亚群的杀伤研究用不同血药浓度(10%、25%、50%、75%和100%)的化疗药物多西他赛、表阿霉素和氟尿嘧啶杀伤乳腺癌MCF-7细胞,以杀伤效果最高的血药浓度的药物来杀伤CD55hig细胞和CD55low细胞,酸性磷酸酶法测定活细胞数检测其杀伤效应;抽取人外周血,淋巴细胞分离液分离收集单个核细胞,以IFN-γ(1500 U/ml)、抗CD3单抗(100 ng/ml)、IL-1α(100 U/ml)和IL-2(1000 U/ml)诱导培养,流式细胞检测CIK细胞的表型分子CD3、CD4、CD8和CD56表达,培养14天后收集CIK细胞,以效应细胞比靶细胞40:1杀伤CD55hig细胞和CD55low细胞,酶标检测仪检测杀伤率;术中严格无菌摘取乳腺癌引流淋巴结1~2枚,用机械法获取淋巴细胞悬液,并用淋巴细胞分离液分离单个核细胞,以RPMI1640完全培养基重悬、培养2h,贴壁细胞以rhGM-CSF(1000U/ml), rhIL-4(200U/ml)和TNF-α(200U/ml)联合培养诱导DCs;非贴壁细胞,加入rhIL-2(200U/ml)培养为TDLNCs。分选收集MCF-7细胞中CD55hig细胞,通过冻融法制备肿瘤抗原,负载DCs,将后者与TDLNCs共培养,以诱导肿瘤特异性CTLs。分别培养至第1天和第7天收获DCs,流式细胞分析仪检测其CD1a、CD83和CD86细胞表型,用非放射性细胞毒分析试剂盒,检测CTLs细胞对CD55hig细胞和CD55low细胞体外杀伤活性,分析经诱导的DCs功能和CTLs杀伤特异性。第三部分原发性乳腺癌组织中CD55hig细胞检测及其临床意义选取2008年2月至2009年1月在我科收治的乳腺癌患者45例。术中切取部分乳腺癌组织,机械法获得细胞悬液,加入抗CD55抗体和抗CK19抗体,对原发性乳腺癌单细胞悬液进行免疫荧光标记,以流式细胞学方法进行检测CD55高表达(CD55hig)群细胞的比例。结合患者的临床资料,分析乳腺癌患者CD55高表达与临床病理学指标的关系。结果:1 MCF-7细胞染色Hoechst3342染料后,流式细胞分析SP比例为4.34±0.59%,而加入维拉帕米后显著减低为0.1±0.07%。2收集SP和MP细胞,分别标记CD55单克隆抗体后,流式细胞术测定SP细胞CD55的平均荧光密度值为100.85±4.57,MP细胞CD55的平均荧光值为50.51±4.75;CD55单克隆抗体标记未分选的MCF-7细胞,流式细胞仪分析CD55hig细胞比例为2.12±0.39%。3 CD55hig和CD55low细胞接种后6h、12h和18h,贴壁率分别为29.53±1.20%、46.40±2.99%、77.2±1.07%和40.87±1.55%、55.40±2.46%、85.10±3.36%,CD55hig细胞贴壁率低于CD55low亚群细胞,P<0.05,差异有统计学意义;接种24h后,CD55hig细胞贴壁率为95.5±1.1%,CD55low细胞贴壁率为96.3±0.96%,P>0.05,无统计学差异。接种12h后,显微镜下观察CD55hig细胞多为球形呈悬浮状态,而CD55low细胞已贴壁为梭形。4 CD55hig细胞和CD55low细胞均具有一定克隆形成的能力,CD55hig细胞在培养一周后克隆形成率为20.04±1.07%,低于CD55low细胞27.14±1.07%,P=0.000,差异有统计学意义。5流式分析发现,CD55hig细胞中G0/G1静止期细胞占85.4±3.37%,明显高于CD55low细胞(58.6±2.55%)及MCF-7细胞(70.73±4.21%),P值均<0.05 ,有统计学差异。CD55hig细胞处于增殖期的S期细胞仅占13.93±3.45% ,明显低于CD55low细胞( 40.36±2.56% )及MCF-7细胞(24.93±2.86%),P值均<0.05,差异有统计学意义。6不同血药浓度化疗药物对MCF-7细胞杀伤效果不一,多西他赛组5个浓度中以10%血药浓度对MCF-7细胞杀伤效果最高57.3±4.75%,表阿霉素组和氟尿嘧啶组以100%血药浓度最高,分别为40.2±2.46%和26.6±2.44%,高于其他浓度杀伤效果。7 (10%血药浓度)多西他赛、(100%血药浓度)表阿霉素和(100%血药浓度)氟尿嘧啶对CD55hig亚群细胞杀伤率为28.5±0.04%、18.4±0.02%和12.4±0.01%,明显低于其对MCF-7细胞杀伤率,P值均小于0.05,差异有统计学意义;对CD55low亚群细胞杀伤率为58.8±0.06%、45.4±2.28%和34.3±0.01%,P值均大于0.05,无统计学差异。8 CIK细胞对三组细胞都有杀伤,CIK细胞对MCF-7、CD55hig亚群细胞和CD55low亚群细胞杀伤率为39.15±3.30%、42.72±4.36%和46.41±4.67%, CD55low亚群细胞组杀伤率与MCF-7组(P=0.000)和CD55hig亚群细胞组杀伤率(P=0.046)相比,P值均小于0.05,差异有统计学意义;MCF-7组和CD55hig亚群细胞组杀伤率相比,P=0.053,无统计学差异。9诱导前的TDLNCs中,CD3+和CD8+细胞含量分别为73.93±2.18和32.78±3.21%;诱导后DC-Ag-TDLNC组中CD3+和CD8+细胞含量分别为82.67±2.79%和62.54±2.51%,诱导后CD3+、CD8+T细胞含量均明显升高, P<0.01。诱导前TDLNCs中CD4+细胞含量为27.3±2.58%;CD4+细胞含量无明显变化,P>0.05。10特异性CTL对CD55hig、CD55low和MCF-7细胞杀伤率分别为52.86±4.45%、22.41±2.83%、21.67±4.15%,CD55hig组明显高于CD55low和MCF-7组细胞的杀伤率,P<0.001,CD55low和MCF-7组细胞的杀伤率相比较无统计学意义,P=0.629。11多西他赛(10%血药浓度)、CIK细胞和特异性CTL细胞对CD55hig细胞的杀伤率分别为:28.5±0.04%、42.72±4.36%和52.86±4.45%;特异性CTL细胞组与CIK细胞组和多西他赛(10%血药浓度)组相比较,P均为0.000,CIK细胞组与多西他赛(10%血药浓度)组相比较,P=0.000。12本实验测得原发性乳腺癌肿瘤组织中CD55hig比例为0.21±0.20%,较乳腺癌细胞株MCF-7所测CD55hig的比例2.12±0.39%低。13乳腺癌患者组织中CD55hig比例随着淋巴结转移数目增加而增高,0个腋淋巴结转移组、1～3个腋淋巴结转移组和≥4个腋淋巴结转移3组间比较,P =0.000,差异有统计学意义,三组之间两两比较,均有统计学差异。14乳腺癌患者组织中C-erbB2(++-+++)组CD55hig比例为0.277±0.034%,较C-erbB2(-)组的CD55hig比例(0.028±0.005%)有明显的升高,P=0.000,差异有统计学意义。15 CD55hig比例在乳腺癌不同病理类型之间、不同临床分期之间、ER(-)与ER(+-+++)组之间、PR(-)与PR(+-+++)组之间、Ki67(-),Ki67(+-+++)组之间的差异均无统计学意义,P>0.05。16本研究发现,CD55hig比例在术前化疗组与未化疗组的比较中无统计学差异,P =0.448。结论:1以核酸染料Hoechst33342标记乳腺癌细胞株MCF-7细胞,流式细胞检测发现有淡染的SP细胞,verapamil阻断后此部分细胞明显减少,SP细胞为肿瘤干细胞。2 CD55单克隆抗体标记分选出的SP和MP细胞,检测发现SP细胞CD55荧光值高于MP细胞的荧光值,以此值检测CD55单克隆抗体标记的未分选的MCF-7细胞,发现存在少量的CD55hig细胞。3 CD55hig细胞大多数处于静止期、不贴壁呈悬浮状态和克隆遗传性,CD55hig细胞具有肿瘤干细胞生物学特性。4三种化疗药物对乳腺癌细胞系MCF-7、CD55hig和CD55low细胞均有杀伤效果,但是由于CD55hig细胞绝大多数处于细胞分裂静止期,化疗药物对其杀伤效果不显著。5 CIK细胞对乳腺癌细胞系MCF-7、CD55hig和CD55low细胞杀伤效应有显著差异,CIK细胞杀伤效果高于化疗药物,但是没有特异性杀伤效果。6经CD55hig细胞冻融抗原刺激诱导的DCs可以使TDLNCs增殖、分化为肿瘤抗原特异性CTLs,针对CD55hig细胞具有较强的杀伤效应,而对其他类型的肿瘤细胞无明显杀伤效应。7特异性CTL细胞对CD55hig细胞具有特异性杀伤效果,其杀伤效果高于CIK细胞和化疗药物,为乳腺癌干细胞的治疗提供新的方法和依据。8流式细胞检测乳腺癌组织中CD55hig细胞比例为0.21±0.20%。9乳腺癌组织中CD55hig细胞比例与腋淋巴结转移的数量、C-erbB2的表达呈正相关联性,与病理类型、临床分期、ER、PR、KI67表达及术前化疗无明显相关,推测CD55hig比例与乳腺癌的转移和病情的进展有相关联性。