论文部分内容阅读
目的1.对自行研制的压电石英生物传感器检测平台进行改进。2.用凝胶迁移率实验（Electrophoretic mobility shift assay,EMSA）验证NF-κB顺式元件（DNA）探针与特异性蛋白NF-κB的p65亚基和核蛋白的特异性结合。3.建立基于蛋白质—DNA相互作用的新型压电生物传感器及其影响因素探讨,并优化出最佳反应条件。方法1.利用精细微加工法制作石英晶体,在其表面光刻金膜电极,石英晶体AT切型、13×13mm、基频10MHz、金膜电极直径4.0mm,与检测池组装后形成传感器检测单元,传感器检测单元在检测仪上构成2×5型拔插式传感器阵列。频率记录分析软件从PESA-2.0升级到PESA-4.0,新软件采用Visual C++语言设计,增加多项功能使其更适用于实验研究和临床检测的需要。对构建好的压电传感器检测平台进行气液相稳定性实验及阵列检测稳定性实验。2.用EMSA验证NF-κB顺式元件（DNA）探针与特异性蛋白NF-κB的结合特异性。3.将NF-κB顺式元件（DNA）探针通过巯基化法固定在传感器的金膜表面,并与特异性蛋白NF-κB的p65亚基进行结合反应,通过计算机采集分析传感器频率数据,比较不同探针浓度、不同pH值、不同离子浓度下频率的变化,经SPSS软件进行单因素分析选择最佳反应条件。4.以不同浓度p65蛋白为标准品,绘制p65检测标准曲线,并对核蛋白提取物进行检测。同时,通过更换不同序列的巯基化探针,探讨传感器检测的特异性。结果1.AT切型石英晶体液相起振能力强、频率稳定适合压电生物传感器检测要求,传感器组装后,气、液相检测稳定性好,调稳后10分钟内气相频率变化不超过±1Hz、液相不超过±2Hz。2.为了满足临床检测的需要,新编PESA-4.0软件增加了如病人信息录入、历史结果查阅、曲线拟合、定标等多项功能,其中频率自动更新和图像编辑等功能的添加对实验室研究也有较大帮助。3.EMSA电泳结果显示标记了同位素的探针与NF-κB的p65亚基和核蛋白提取物的结合较空白对照产生了滞后的电泳条带,说明了探针和蛋白结合的特异性。样品空白泳道未加入蛋白固没有特异性结合条带。4.运用构建的压电石英晶体传感器检测p65标准蛋白,探针固定浓度为2.0μmol/L,pH值为7.5,MgCl2离子强度为50mmol/L时结合反应条件最佳。并确定结合反应最终反应时间为15min。5.压电生物传感器对不同浓度p65进行检测,在10-40ng/μl浓度范围p65浓度与频率下降呈线性相关,同时对传感器的非特异性响应信号进行检测,非特异性信号响应小,不超过同浓度特异性信号的5%。结论1.构建的压电石英晶体传感器检测系统硬件设计较完善,工作稳定,软件稳定易用,功能较完善,整个检测系统可以应用于检测和研究。为临床检测开发的PESA-4.0分析软件对实验研究也有较大帮助。2.压电传感器检测取得了较好的结果,检测时间确定为15min,非特异性信号小,说明构建的传感器特异性好,选择性高,显示该平台在研究反式作用因子方面有较好的应用前景。3.EMSA电泳实验验证说明本实验设计的特异性探针与NF-κB能发生特异性结合反应,表明本研究构建的传感器具有良好的检测特异性。4.本研究构建的传感器检测平台较传统的EMSA方法有一定的优势,无需同位素标记,反应时间短,能高通量实时在线观察蛋白质和DNA的相互作用,为研究真核基因表达调控提供新型技术平台。