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目的:用VEGF165诱导人脂肪间充质干细胞(human adipose-derived mesenchymal stem cells,h ADSCs)向内皮细胞分化,通过γ-内分泌酶抑制剂(DAPT)对诱导分化进行干预,检测细胞的分化程度、Notch信号的表达、细胞迁移能力及成血管能力的变化,探究Notch信号通路在VEGF所诱导的h ADSCs向内皮细胞分化中的作用。方法:1、脂肪组织来源于遵义医学院附属医院整形外科住院的3例患者,经病人同意并签署知情同意书后,手术室无菌条件下收集标本,采取器械剪切、酶消化及离心法提取h ADSCs,用含胎牛血清的DMEM培养基培养细胞并传代,倒置显微镜下观察细胞形态,流式细胞仪检测细胞表面标志CD29、CD31、CD34及CD44的表达;取传代至第3代的h ADSCs,用VEGF165诱导其向内皮细胞分化,14天后流式检测内皮细胞表面抗原的表达。2、取传代至第3代的h ADSCs分为2组:对照组:h ADSCs;诱导组:h ADSCs+50ng/m L的VEGF165。实时荧光定量PCR法及Western bolt电泳法检测两组细胞培养至7天及14天时Notch1,Notch14及Dll4的m RNA和蛋白的表达。3、取传代至第3代的h ADSCs分为3组:对照组:传至第三代的h ADSCs;诱导组:h ADSCs+VEGF165(50ng/m L);干预组:VEGF165(50ng/m L)+h ADSCs+DAPT(三个不同浓度2.5ug/ml、10ug/ml、25ug/ml);各组细胞培养至7天及14天后,分别用流式细胞仪检测内皮细胞表面特异性抗原VE cadherin和CD31表达程度。用Transwell小室检测上述细胞的细胞迁移能力。4、取传代至第3代的h ADSCs分为3组,分组及处理情况同细胞迁移实验,将上述三组细胞培养至7天和14天后,分别取约2×104个细胞移植于铺好Matrigel基质胶中的96孔板上,37℃培养箱中孵育6h后显微镜拍照并分析体外血管生成能力。5、取传代至第3代的h ADSCs分为3组,分组及处理情况同细胞迁移实验,将上述三组细胞分别培养7天后,取各组对应的新的细胞培养液和融化的Matrigel基质胶混合,再与三组细胞分别混匀,植入裸鼠侧肋部皮下,7天后颈椎脱臼处死裸鼠并取出种植的Matrigel胶,观察胶内血管生成情况,切片做CD31免疫化学染色,分析体内血管生成能力。结果:1、从人的脂肪组织中分离出间充质干细胞,细胞形态多为梭形或星形,呈放射集落样生长。流式细胞仪检测细胞表型分析表明,传至第三代的脂肪间充质干细胞表型CD29(96.31%)、CD44(98.91%)呈阳性表达,内皮细胞表型CD31、CD34阴性表达;向内皮细胞诱导14天后CD31(88.38%)、CD34(92.81%)均呈阳性表达,而CD29、CD44的阳性表达率降低。2、q PCR结果显示:对照组和诱导组的细胞中Notch1、Notch4及Dll4的m RNA均有表达,诱导组的相对表达量高于对照组,诱导组中诱导14天的相对表达量比7天的表达高,差异均有统计学意义(P<0.05);Western blot结果显示:诱导组和对照组细胞中Notch1、Notch4及Dll4的蛋白均有表达,诱导组的蛋白相对表达量高于对照组,诱导组中14天的相对表达量比7天的表达高,差异均有统计学意义(P<0.05)。3、流式检测内皮细胞表面特异性抗原VE-cadherin和CD31的阳性率的趋势相同;对照组阳性率最低,均低于1%;诱导组和干预组中14天的阳性率高于7天组;诱导组阳性率高于干预组;干预组中低浓度DAPT组的阳性率高于高浓度DAPT组,差异有统计学意义(P<0.05)。细胞迁移实验中,诱导组的细胞迁移能力最强,干预组次之,对照组细胞迁移能力最弱;诱导组和干预组中14天的细胞迁移能力较7天强,干预组中低浓度DAPT组的细胞迁移能力较高浓度组的迁移能力强,差异有统计学意义(P<0.05)。4、体外基质胶Matrigel中的血管生成实验中,对照组中的细胞间成分离状态,未见血管形成;诱导组可见形成闭合的多边形结构或形成复杂的网状结构;干预组中见较多细胞排列呈线,或少数形成网状结构。诱导组的血管生成能力强于干预组;干预组中低浓度DAPT组的血管生成能力较高浓度组强,差异均有统计学意义(P<0.05)。5、三组细胞在裸鼠体内血管生成能力的强弱关系与体外血管生成实验结果一致,CD31免疫化学染色见形成的管腔内壁有内皮细胞着色,证实所成管网为血管网;诱导组有大量管腔形成,干预组形成的管腔数少于诱导组,(P<0.05);干预组中,低浓度DAPT组的管腔数多于高浓度DAPT组,(P<0.05);对照组偶见管腔形成。结论:(1)在h ADSCs向内皮细胞分化过程中,VEGF能上调Notch信号通路的表达。(2)阻断Notch信号通路能抑制hADSCs向内皮细胞分化。(3)阻断Notch信号通路能抑制h ADSCs所分化成的内皮细胞的迁移能力及在体内、外的血管生成能力。