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研究目的:本实验研究香烟烟雾提取物(Cigarette Smoke Extract,CSE)是否能诱导RLE-6TN细胞发生线粒体自噬,并进行了相关机制的初步探讨,为慢性阻塞性肺疾病(Chronic Obstructive Pulmonary Disease,COPD)的治疗提供新的思路。研究方法:1.MTT比色法测定香烟烟雾提取物(Cigarette Smoke Extract,CSE)对RLE-6TN细胞生长的抑制作用,确定CSE的最适刺激时间和浓度。2.透射电镜检测RLE-6TN细胞在CSE刺激下的线粒体形态变化。3.流式细胞术或多功能酶标仪定量检测方法检测RLE-6TN细胞线粒体膜电位(Mitochondrial Membrane Potential,MMP)、细胞内活性氧(Reactive Oxygen Species,ROS)水平、线粒体内ROS水平及ATP的变化。4.Western blotting方法和免疫组织化学法检测LC3B、P62的表达水平。5.Western blotting方法检测细胞总蛋白和线粒体/胞浆蛋白中PINK1、Parkin、Drp1及Mfn2的表达水平。6.质粒EGFP-LC3B转染联合Mito-Tracker Orange荧光染色方法对RLE-6TN细胞在CSE刺激下LC3B与线粒体共定位情况进行观察。研究结果:1.CSE对RLE-6TN细胞的生长抑制呈剂量依赖关系。选定5%CSE处理12h进行后续实验。2.CSE能诱导RLE-6TN细胞发生形态学变化:细胞内空泡明显增多,吞噬小体增加,线粒体肿胀变形。3.CSE能诱导RLE-6TN细胞发生线粒体损伤:线粒体膜电位降低,细胞内ROS含量增高,线粒体内ROS含量增高,细胞内ATP含量降低。4.CSE能诱导RLE-6TN细胞发生自噬现象。Western blotting方法检测细胞总蛋白:与Control组相比,CSE组和CCCP组中LC3-II/LC3-I比值明显升高,CSE组差异具有统计学意义(P﹤0.05);CSE组和CCCP组中P62蛋白含量明显降低。免疫组织化学法染色表明:LC3B和P62主要分布在胞浆。与Control组相比,CSE组中LC3B蛋白阳性表达明显增强,而CSE组中P62蛋白阳性表达则明显减弱。5.CSE能诱导RLE-6TN细胞发生线粒体自噬现象。Western blotting方法检测细胞总蛋白:与Control组相比,CSE组PINK1和Drp1蛋白表达增加(P﹤0.05),Mfn2蛋白表达降低(P﹤0.05),Parkin蛋白表达降低,但差异没有统计学意义(P>0.05)。Western blotting法检测细胞线粒体蛋白:PINK1和Mfn2蛋白在胞浆中无表达,在线粒体中有表达。与Control组相比,CSE组PINK1和Mfn2蛋白表达有所降低;Parkin和Drp1蛋白在线粒体中无表达,在胞浆中有表达。与Control组相比,CSE组Parkin和Drp1蛋白表达增加。6.Mito-Tracker Orange联合EGFP-LC3B质粒转染共定位结果表明:在CSE刺激下,细胞内被Mito-Tracker Orange染成橘色的线粒体能够与表达绿色荧光的EGFP-LC3B重合,提示CSE可导致RLE-6TN细胞发生线粒体自噬。研究结论:1.CSE能够引起RLE-6TN细胞发生线粒体损伤。2.CSE能够引起RLE-6TN细胞发生自噬现象。3.CSE能够引起RLE-6TN细胞发生线粒体自噬现象。4.PINK1-Parkin信号通路可能参与RLE-6TN细胞在CSE损伤下引起的线粒体自噬。