第一部分MicroRNA-223对巨噬细胞抗病毒天然免疫应答调控的机制研究天然免疫是机体抵抗病毒入侵的第一道有效防线,当机体受到病毒感染时,免疫细胞将通过模式识别受体识别病毒成分并活化下游的信号通路,从而表达Ⅰ型干扰素和促炎症细胞因子。其中Ⅰ型干扰素在激发抗病毒免疫应答中发挥至关重要的作用,并且其表达受到机体的精确调控。MicroRNA (miRNA)是近年来发现的一类高度保守的长度约为21～23个碱基的非编码寡聚核苷酸,其功能主要是通过与mRNA的3’非编码区(3’UTR)特异靶位点相互作用从而负向调控mRNA的翻译。miRNA参与调控了多种生物学过程,包括生长、发育、分化、肿瘤的发生和发展等。此外,miRNA在调控天然免疫应答中发挥关键作用,病毒在miRNA层面与机体的相互作用和机制目前受广泛关注。已有多篇关于miRNA参与调控抗病毒天然免疫应答的相关报道,如miRNA-146a和miRNA-155分别在抗病毒天然免疫应答中起着负向和正向的调控作用。因此,我们想通过探求在病毒感染过程中胞内表达改变的miRNA并进一步研究其作用机制,为抗病毒感染提供新的潜在靶点。我们先期通过查阅文献筛选出了一些在髓系细胞中高表达的miRNAs(包括miR-21, miR-25, miR-34a, miR-106a, miR-125b, miR-146a和miR-223),并通过荧光定量PCR (Q-PCR)检测了这些miRNAs在RNA病毒VSV感染小鼠腹腔巨噬细胞的过程中表达水平的变化,发现miR-223的表达显著上调。进一步研究发现,VSV并不是通过自身RNA和蛋白的合成来诱导miR-223的上调,而是通过诱导I型干扰素的产生来促进miR-223的上调的,如果阻断I型干扰素下游信号通路后再用VSV刺激,miR-223的表达将不再上调。之后,我们将合成的siRNA转染到小鼠巨噬细胞中,来模拟内源性miR-223的功能或特异性抑制其作用来进一步研究miR-223的功能,并通过Q-PCR、噬菌斑定量实验、TCID50定量实验、流式细胞术等方法检测了miR-223对RNA病毒感染的影响。结果发现,在小鼠巨噬细胞中过表达miR-223能够上调I型干扰素,抵抗RNA病毒的感染；抑制miR-223后会下调I型干扰素,促进RNA病毒的感染。在分子机制研究中,我们检测了过表达miR-223对RNA病毒活化的下游信号通路关键分子的影响,发现过表达miR-223并没有明显增强p38、ERK、JNK和IκBα的磷酸化,并且对RIG-I的表达、IRF3的磷酸化以及PKR的磷酸化也没有显著影响,但是能够促进IRF7的表达。相反,如果抑制miR-223,IRF7的表达也相应地降低了。文献报道,FOXO3能够抑制IRF7的转录活性,所以我们推测miR-223可能是通过靶向抑制转录因子forkhead box O3 (FOXO3)来促进miR-223的表达的,通过miRNA靶点预测网站分析和荧光素酶报告基因实验验证,发现FOXO3确实是miR-223的一个新的靶点。最后,我们分别通过干扰和过表达FOXO3进一步验证了miR-223确实是通过靶向抑制FOXO3,增强IRF7的转录活性,从而上调I型干扰素发挥抗病毒作用。综上所述,RNA病毒感染能够在小鼠巨噬细胞中通过促进I型干扰素的产生诱导miR-223表达的上调,诱导上调的miR-223又可以通过靶向抑制FOXO3的表达,增强IRF7的转录活性,从而上调I型干扰素的产生来发挥抗病毒作用。该研究结果为巨噬细胞抗病毒天然免疫应答的调控机制增添了新的认识,并可能为抗病毒免疫治疗提供新的思路。第二部分 白细胞介素27对巨噬细胞抗病毒天然免疫应答调控的机制研究Interleukin 27(IL-27)是IL-12细胞因子家族中的一员,它是一种异二聚体的细胞因子,由EBI3和p28两个亚基组成。IL-27的受体也是一个异源二聚体,它是由一条配体结合链IL-27Rα(WSX-1,TCCR)和另一条信号传导链gp130组成。IL-27通过IL-27Rα/gp130传递信号,活化下游分子JAK和STAT1/STAT3.活化的STAT1/STAT3能够调控下游不同T细胞特异性转录因子的活性,例如T-bet (Th1),GATA-3(Th2)and ROR-γt(Th17)等。此外,IL-27受体信号还能够活化MAPK招募并活化下游的转录因子c.Maf和AP1来影响细胞的增殖和分化。近些年来,越来越多的证据表明IL-27在机体的免疫调节中发挥了重要的作用。与多数的细胞因子类似,IL-27在炎症调节中发挥了两面性的作用,既能促进炎症的发生,也能抑制炎症的发生。而目前有关IL-27功能的研究主要集中在IL-27对T细胞分化和功能的影响这方面,关于其在抗病毒天然免疫应答中的作用研究十分有限。因此,本次研究旨在揭示IL-27在巨噬细胞抗病毒天然免疫应答调控中发挥的重要作用。我们发现,RNA病毒VSV感染巨噬细胞的过程中,巨噬细胞内IL-27亚单位mRNA表达显著增加。同时我们发现用重组的小鼠IL-27(rmIL-27)预处理小鼠巨噬细胞能够明显抑制VSV的复制,但是对巨噬细胞中IFN-β的表达无显著影响,表明IL-27可能是通过不依赖I型干扰素的方式发挥抗病毒作用。同时我们还观察到用rmIL-27预处理小鼠巨噬细胞能够抵抗H1N1和HSV的感染。接着我们又在小鼠体内进一步研究了IL-27的抗病毒效应,发现IL-27受体亚基IL-27Rα敲除(IL-27Rα-/-)小鼠相对于同窝对照的野生型(WT)小鼠腹腔对VSV和H1N1的感染更加敏感,同时我们也观察到IL-27受体亚基IL-27Rα敲除对于VSV感染后小鼠血清中的IFN-β的水平无显著影响。在分子机制的研究中,我们通过基因芯片发现rmIL-27处理能够明显上调interferon gamma inducible protein 47 (Ifi47)和interferon inducible GTPase 1 (Iigp1)的表达,于是我们进一步研究了Ifi47和Iigp1在IL-27调控机体抗病毒天然免疫应答过程中发挥的作用,发现IL-27确实是通过上调Ifi47和Iigp1发挥抗病毒作用。同时我们初步探究了IL-27上调Ifi47和Iigp1的具体机制,发现JNK的抑制剂能够明显抑制IL-27诱导的Ifi47和Iigp1的上调,表明IL-27可能是通过JNK信号通路依赖的方式来上调Ifi47和Iigp1。综上所述,我们发现病毒感染能够诱导小鼠巨噬细胞产生IL-27,而巨噬细胞自分泌的IL-27或者外源添加的重组IL-27细胞因子可能通过与巨噬细胞表面的IL-27受体结合后活化下游的JNK信号通路,上调抗病毒基因Ifi47和Iigp1的表达,从而发挥抗病毒作用。上述研究结果为IL-27在抗病毒天然免疫中的功能提供了新的认识,并可能为IL-27用于抗病毒治疗提供依据。