论文部分内容阅读
丙型肝炎病毒(Hepatitis C Virus, HCV)是黄病毒家族的肝炎病毒属,是具有包膜糖蛋白的单股正链RNA病毒,感染人肝脏后主要引起慢性感染。全球约有1.7亿人口感染HCV,70%的急性感染患者进展为慢性感染,并常进一步发展为肝纤维化和肝癌。HCV共有6-7个基因型,其中基因型1,2,3在世界范围内流行,基因型4主要在埃及,基因型5主要在南非,基因型6主要在东南亚,我国流行的HCV主要是1b型和2型。HCV的传播主要通过非肠道途径,据WHO统计,仅通过不安全的注射途径导致的HCV新增感染每年约有2百万人。迄今为止,HCV尚无有效的疫苗,其治疗主要是聚乙二醇化干扰素联合利巴韦林的给药方案。该治疗方法价格昂贵,其治疗效果与HCV的基因型有一定相关性,并有一定副作用。因此研发新型的HCV疫苗对于HCV的治疗及预防十分迫切和必要。E1和E2包膜糖蛋白对于HCV的进入和感染有重要作用,其存在的丰富N-糖链能调节抗原性和免疫原性。本研究内容主要是通过采用PCR的方法扩增HCV1a型E1E2的基因,用定点突变PCR手段将E1E2基因上特定的N-糖基化位点突变,同时在E1E2的N端和C端同时引入小鼠特异性的CpG序列GACGTT,将其构建到真核表达载体pVAX-1上。然后将这些重组DNA疫苗在IL-2作为佐剂的情况下用基因导入仪肌肉注射Balb/C小鼠,剂量为30μg/只,免疫三次后,再用E2蛋白加强免疫一次。我们的结果显示,N-糖基化突变体与E1E2野生型(WT) DNA重组质粒均能在小鼠体内外有效表达；与E1E2-WT组以及其他突变体组相比,E1E2-M5能诱导最高水平的E2特异性总IgG和IgG1以及IL-4的产生；而CpG-E1E2-M4诱导最高水平IgG2a和IFN-y的产生;同时CpG-E1E2-M4还增强了小鼠CD8+T细胞的CTL活性以及对抗原特异性CT26肿瘤细胞的体内抑制作用。以上结果均表明,CpG-E1E2-M4诱导了以Th1为主的细胞免疫应答。为了检测N-糖苷对DC的影响,我们将免疫后小鼠的DC进行体外培养并用E2抗原进行刺激12小时后,检测DC中IL-10和IL-12的表达,结果显示,CpG-E1E2-M4促进DC中IL-12的表达;将DC与免疫后小鼠的CD4/CD8+T细胞进行共培养,我们发现,CpG-E1E2-M4免疫后小鼠的DC进一步促进了CD4+T细胞中IFN-γ的表达以及CD8+T细胞的穿孔素和颗粒酶B(GrB, Granzyme B)的表达。以上结果进一步表明,CpG-E1E2-M4增强了DC的抗原递呈功能,诱导Thl型免疫应答。在病毒感染早期,中和性抗体对于HCV的清除发挥重要作用。E1E2是诱导中和性抗体产生的重要靶点。将各糖基化突变体DNA疫苗免疫后的小鼠血清与HCVcc共孵育后再感染Huh7.5.1细胞,结果表明,CpG-E1E2-M4诱导中和性抗体产生,在体外能显著抑制HCVcc (HCVcc, cell-culture derived HCV (JFH-1,2a型)和6个基因型的HCV假病毒(HCVpp, HCV pseudoparticle)的感染；免疫后小鼠抗血清中和HCVcc的EC50(concentration for50%of maximal effect)为16.8μg/ml,显著低于CpG-E1E2-WT, E1E2-WT和E1E2-M4组的EC50,表明CpG-E1E2-M4诱导中和性抗体的效价最高。为了进一步验证CpG-E1E2-M4产生的抗体的中和作用,我们制备了针对CpG-E1E2-M4的单克隆抗体1C2,病毒中和实验的结果表明,1C2能有效抑制JFH-1和HCV病人血清感染Huh7.5.1细胞,其EC50为10.82μg/ml；该单抗的中和性表位为F550-G572(P10)和Y489-C508(P7)；单抗1C2抑制HCV感染主要是通过阻断HCV E2与受体CD81的结合实现的。HCV感染的宿主主要是人和黑猩猩,长期以来由于小动物模型的缺乏致使对HCV疫苗以及小分子药物的研究受到阻滞。为了验证单抗1C2在小动物模型中防治HCV感染的效果,我们制备了HCV受体CD81，SRB1，OCLN和CLDN-1转基因的人源化小鼠模型。单抗1C2与HCVcc在体外孵育后,再进行转基因小鼠攻毒,验证单抗1C2对人源化小鼠体内HCV感染的中和作用。综上所述,我们对HCV E1E2包膜糖蛋白糖基化突变体疫苗进行评估。首先筛选获得CpG-E1E2-M4的DNA疫苗,其能够提高机体的细胞免疫水平,并诱导中和性抗体的产生；其次制备了糖基化突变体CpG-E1E2-M4的单抗1C2,该单抗为IgG2a型的抗体,在体外能中和HCV对Huh7.5.1细胞的感染；最后制备了人源受体转基因小鼠,并在人源化小鼠体内进一步验证单抗1C2中和病毒的效果。总之,本研究为HCV的防治提供了新的研究工具和策略。