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周质空间是革兰氏阴性细菌特有的细胞结构。与革兰氏阳性细菌不同的是，在革兰氏阴性细菌中，细胞壁的肽聚糖层之外还包被有一层外膜结构。外膜和内膜这两层膜结构之间所包围的空间，就是革兰氏阴性细菌的周质空间。作为革兰氏阴性细菌特有的一种最基本的细胞结构，一个稳定的周质空间对于革兰氏阴性细菌的生命活动来说是极其重要的。而要维系住周质空间的结构，最核心的是维持住外膜结构的稳定性。在大肠杆菌中，有多种蛋白参与并执行维系住外膜结构稳定的功能，包括Lpp、Pal、OmpA等。这其中最主要的，也是发挥着最重要功能的，是Lpp。
Lpp是一种脂蛋白，其N端连接的三个脂肪酸分子能够插入到大肠杆菌的外膜之中，其C端能够通过共价键连接的方式，“锚定”在细胞壁肽聚糖上。通过这种同时“锚定”肽聚糖和连接外膜的方式，Lpp稳定地拉拽住外膜并且维系住外膜的稳定性。而Lpp也是大肠杆菌中迄今为止发现的唯一一种能够通过共价键连接在细胞壁肽聚糖上的蛋白。Lpp在γ-变形菌纲的肠杆菌目、弧菌目、假单胞菌目等多个目的细菌类群中广泛存在。
尽管过去50多年里对Lpp的研究已经比较深入，但是有很多关键的科学问题仍然没有得到解决。其中最重要的一个问题就是，至今科研人员依然无法有效的通过各种显微手段观察到Lpp，这也对Lpp的深入研究造成了重要的限制。本硕士研究课题通过使用原子力显微镜(atomic force microscopy，AFM)技术，成功实现了对大肠杆菌Lpp的直接观察，并结合分子、生化、显微观察等一系列技术手段，深入研究大肠杆菌Lpp在细胞内的生理功能，大肠杆菌L，D转肽酶基因对Lpp蛋白锚定的影响，以及Lpp在其他菌株中的多样性，并为后续Lpp生理功能的相关科学研究提供重要依据。本论文具体研究结果如下:
1.大肠杆菌细胞壁结合蛋白Lpp的观察与鉴定
我们使用高分辨率原子力显微镜技术对大肠杆菌细胞壁进行了观察研究。在高分辨率原子力显微镜下，细胞壁表面布满密度极高的颗粒状结构。经蛋白酶酶解实验及对酶解物进行质谱分析之后，发现酶解后得到的肽段来自大肠杆菌的Lpp蛋白。然后我们在大肠杆菌中敲除掉了lpp基因，敲除株细胞壁上的颗粒状物质完全消失。最后我们对敲除株进行了lpp基因回补，高密度的颗粒状结构在细胞壁上重新复现。通过一系列实验，最终证实我们使用原子力显微技术在大肠杆菌细胞壁表面观察到的颗粒状物质即Lpp蛋白。
2.大肠杆菌Lpp对细胞生理功能的影响
为了探究大肠杆菌细胞壁结合蛋白Lpp对细胞生理功能影响，我们对大肠杆菌WT/ΔLpp/cpLpp株进行了一系列生理功能的探究。当Lpp基因缺失时，细菌菌体形态出现变化，表面出现囊泡结构，测其正常生长条件下的生长曲线却又与野生型无明显差异，说明Lpp蛋白在大肠杆菌中的缺失并不影响其正常生存。接着又对大肠杆菌WT/ΔLpp/cpLpp菌株进行了渗透压敏感性、EDTA敏感性和压力敏感性测定，结果表明当Lpp的基因缺失时，菌株渗透压敏感性、EDTA敏感性和压力敏感性大幅度增强，Lpp的缺失会导致大肠杆菌细胞壁功能受损，周质空间稳定性降低，细胞维持自身机械性能，细胞形态以及抵抗环境压力等方面能力降低。
3.大肠杆菌L，D转肽酶基因对Lpp蛋白锚定的影响
在大肠杆菌中，LdtA、LdtB、LdtC这三种转肽酶参与了将Lpp连接到细胞壁肽聚糖层上的过程。我们对大肠杆菌菌株进行了L，D转肽酶基因LdtA/LdtB/LdtC的单/双/三敲除，提取细胞壁进行AFM观察分析以探究L，D转肽酶LdtA/LdtB/LdtC对Lpp蛋白锚定的影响。在对数生长期的大肠杆菌中，LdtB对Lpp向细胞壁肽聚糖层的连接起到主要作用，LdtA和LdtC起到次要作用;在稳定期的大肠杆菌中，LdtA和LdtB对Lpp向细胞壁肽聚糖层的连接起到主要作用，LdtC起到次要作用。三种Ldt中，LdtC对于Lpp的连接起到的作用较为次要，LdtA发挥功能主要是在稳定期，而LdtB不论在对数期还是稳定期都能发挥重要作用。
4.Lpp蛋白在革兰氏阴性细菌中的多样性
通过对来自革兰氏阴性细菌的Lpp进行比对分析，我们发现Lpp在革兰氏阴性细菌的肠杆菌目、交替单胞菌目、弧菌目、假单胞菌目等多个目的细菌类群中广泛存在，不同细菌种属来源的Lpp蛋白的氨基酸残基序列在结构上较为保守。通过进化树分析，我们可以发现不同目来源的Lpp一般都聚集在同一个簇上，说明Lpp的序列的保守程度与所来源的菌株所属的分类单元是相关的。
我们在分析了不同种属细菌来源的Lpp蛋白序列的基础上，选取了两株基因组中含有lpp的肠杆菌目的细菌Kluyverageorgiana和Pantoeaagglomerans，和一株基因组中不含有忉基因的交替单胞菌目的细菌Psychrobactersp.，提取了其细胞壁，并开展了高分辨率AFM超微结构的比对研究。研究结果发现，我们在革兰氏阴性细胞壁上观察到的颗粒状结构，与基因组中是否存在lpp基因可能是会有相关性的。
Lpp是一种脂蛋白，其N端连接的三个脂肪酸分子能够插入到大肠杆菌的外膜之中，其C端能够通过共价键连接的方式，“锚定”在细胞壁肽聚糖上。通过这种同时“锚定”肽聚糖和连接外膜的方式，Lpp稳定地拉拽住外膜并且维系住外膜的稳定性。而Lpp也是大肠杆菌中迄今为止发现的唯一一种能够通过共价键连接在细胞壁肽聚糖上的蛋白。Lpp在γ-变形菌纲的肠杆菌目、弧菌目、假单胞菌目等多个目的细菌类群中广泛存在。
尽管过去50多年里对Lpp的研究已经比较深入，但是有很多关键的科学问题仍然没有得到解决。其中最重要的一个问题就是，至今科研人员依然无法有效的通过各种显微手段观察到Lpp，这也对Lpp的深入研究造成了重要的限制。本硕士研究课题通过使用原子力显微镜(atomic force microscopy，AFM)技术，成功实现了对大肠杆菌Lpp的直接观察，并结合分子、生化、显微观察等一系列技术手段，深入研究大肠杆菌Lpp在细胞内的生理功能，大肠杆菌L，D转肽酶基因对Lpp蛋白锚定的影响，以及Lpp在其他菌株中的多样性，并为后续Lpp生理功能的相关科学研究提供重要依据。本论文具体研究结果如下:
1.大肠杆菌细胞壁结合蛋白Lpp的观察与鉴定
我们使用高分辨率原子力显微镜技术对大肠杆菌细胞壁进行了观察研究。在高分辨率原子力显微镜下，细胞壁表面布满密度极高的颗粒状结构。经蛋白酶酶解实验及对酶解物进行质谱分析之后，发现酶解后得到的肽段来自大肠杆菌的Lpp蛋白。然后我们在大肠杆菌中敲除掉了lpp基因，敲除株细胞壁上的颗粒状物质完全消失。最后我们对敲除株进行了lpp基因回补，高密度的颗粒状结构在细胞壁上重新复现。通过一系列实验，最终证实我们使用原子力显微技术在大肠杆菌细胞壁表面观察到的颗粒状物质即Lpp蛋白。
2.大肠杆菌Lpp对细胞生理功能的影响
为了探究大肠杆菌细胞壁结合蛋白Lpp对细胞生理功能影响，我们对大肠杆菌WT/ΔLpp/cpLpp株进行了一系列生理功能的探究。当Lpp基因缺失时，细菌菌体形态出现变化，表面出现囊泡结构，测其正常生长条件下的生长曲线却又与野生型无明显差异，说明Lpp蛋白在大肠杆菌中的缺失并不影响其正常生存。接着又对大肠杆菌WT/ΔLpp/cpLpp菌株进行了渗透压敏感性、EDTA敏感性和压力敏感性测定，结果表明当Lpp的基因缺失时，菌株渗透压敏感性、EDTA敏感性和压力敏感性大幅度增强，Lpp的缺失会导致大肠杆菌细胞壁功能受损，周质空间稳定性降低，细胞维持自身机械性能，细胞形态以及抵抗环境压力等方面能力降低。
3.大肠杆菌L，D转肽酶基因对Lpp蛋白锚定的影响
在大肠杆菌中，LdtA、LdtB、LdtC这三种转肽酶参与了将Lpp连接到细胞壁肽聚糖层上的过程。我们对大肠杆菌菌株进行了L，D转肽酶基因LdtA/LdtB/LdtC的单/双/三敲除，提取细胞壁进行AFM观察分析以探究L，D转肽酶LdtA/LdtB/LdtC对Lpp蛋白锚定的影响。在对数生长期的大肠杆菌中，LdtB对Lpp向细胞壁肽聚糖层的连接起到主要作用，LdtA和LdtC起到次要作用;在稳定期的大肠杆菌中，LdtA和LdtB对Lpp向细胞壁肽聚糖层的连接起到主要作用，LdtC起到次要作用。三种Ldt中，LdtC对于Lpp的连接起到的作用较为次要，LdtA发挥功能主要是在稳定期，而LdtB不论在对数期还是稳定期都能发挥重要作用。
4.Lpp蛋白在革兰氏阴性细菌中的多样性
通过对来自革兰氏阴性细菌的Lpp进行比对分析，我们发现Lpp在革兰氏阴性细菌的肠杆菌目、交替单胞菌目、弧菌目、假单胞菌目等多个目的细菌类群中广泛存在，不同细菌种属来源的Lpp蛋白的氨基酸残基序列在结构上较为保守。通过进化树分析，我们可以发现不同目来源的Lpp一般都聚集在同一个簇上，说明Lpp的序列的保守程度与所来源的菌株所属的分类单元是相关的。
我们在分析了不同种属细菌来源的Lpp蛋白序列的基础上，选取了两株基因组中含有lpp的肠杆菌目的细菌Kluyverageorgiana和Pantoeaagglomerans，和一株基因组中不含有忉基因的交替单胞菌目的细菌Psychrobactersp.，提取了其细胞壁，并开展了高分辨率AFM超微结构的比对研究。研究结果发现，我们在革兰氏阴性细胞壁上观察到的颗粒状结构，与基因组中是否存在lpp基因可能是会有相关性的。