腺苷三磷酸结合盒转运蛋白(ATP—binding cassette transporter),ABC转运蛋白)是一类广泛存在于古细菌、细菌和真核生物中的膜蛋白.ABC转运蛋白可以参与多种内外源有毒物质的吸收、积累和排泄,在机体组织防御过程中起着重要作用,与动物或昆虫的抗药性密切相关.中华按蚊是疟疾和马来丝虫病的重要传播媒介,广泛分布于东亚及东南亚地区.由于拟除虫菊酯类杀虫剂(尤其是溴氰菊酯)的广泛使用,中华按蚊对该类药物的抗性已日趋严重,成为蚊虫防治的主要障碍.目前,尚无关于中华按蚊ABC转运蛋白基因及其与溴氰菊酯抗性的研究报道.本研究拟通过生物信息学分析方法,对中华按蚊基因组数据库中潜在的ABC转运蛋白基因进行鉴定、并对其命名、结构域、基因结构、scaffold分布和系统发育等进行研究,为进一步研究中华按蚊ABC转运蛋白基因的功能提供重要的信息基础.通过RNA-seq和qPCR对中华按蚊中与溴氰聚酯抗性相关ABC转运蛋白基因进行筛选,采用 RNAi、ATPase 活性检测以及分子对接对筛选基因进行功能学研究.本文的主要研究内容和结果包括:
　　① 基于中华按蚊基因组数据,我们在中华按蚊中鉴定出61个ABC转运蛋白基因.根据ABC转运蛋白NBD序列的同源性,将它们分为8个亚家族,并对每个成员进行了系统命名.ABC转运蛋白基因的结构域组成形式多样,包括全分子、不完全分子、半分子以及四分之一的ABC转运蛋白基因.ABCG亚家族含有21个成员,是中华按蚊ABC亚家族中数量最多的一个,占总ABC转运蛋白基因的34%.ABCE亚家族仅含有1个ABC转运蛋白基因,是中华按蚊中数量最少的亚家族.系统进化分析发现,ABCB、ABCD、ABCE、ABCF和ABCH是中华按蚊中进化较为保守的亚家族,各亚家族基因与冈比亚按蚊和黑腹果蝇基因成对应的直系同源关系;ABCA、ABCC和ABCG亚家族基因与冈比亚按蚊ABC转运蛋白基因有明显的直系同源关系,而且ABCC和ABCG亚家族经历了基因复制事件.
　　② 利用RNA-seq技术,我们对三个野外抗性种群(AH-FR、CQ-FR和YN-FR)和一个实验室敏感品系(WL-LS)的所有ABC转运蛋白基因表达水平进行了分析比较.结果显示,有6个基因(AsABCG28、AsABCA5、AsABCC9、AsABCC11、AsABCG7和AsABCG23)至少在一个抗性种群中存在显著表达差异.其中,AsABCG28是唯一一个在三个种群中均显著上调的基因.qPCR结果显示,溴氰菊酯处理中华按蚊成蚊6 h后,三个ABCB基因(AsABCB1、AsABCB3和AsABCB5)显著上调表达,而AsABCG28基因在处理后12和24 h,均表现为显著上调表达.
　　③ 通过T7试剂盒体外合成AsABCG28同源的特异dsRNA,采用饲喂法导入 2日龄中华按蚊幼虫体内.qPCR结果显示,AsABCG28基因的表达量显著降低, AsABCG28基因沉默能显著提高溴氰菊酯引起中华按蚊幼虫的致死率.
　　④ 采用质粒pPICZA构建重组质粒AsABCG28/pPICZA,线性化后电转化毕氏酵母Pichia pastroisGS115,通过Zeocin抗生素筛选得到高拷贝重组子.甲醇诱导表达24 h后收集菌体,通过组织研磨法、超速离心法及镍亲和层析法相结合纯化目标产物,每1 L发酵液可获得0.1 mg重组蛋白AsABCG28,其ATPase活性为25 nmol/mg/min.在测定浓度范围内(0-1 mM),溴氰菊酯对重组蛋白AsABCG28 ATPase 活性无诱导作用,而溴氰菊酯代谢产物 3-苯氧基苯甲酸对 ATPase 活性具有显著诱导作用,且呈剂量效应关系.分子对接结果显示,3-苯氧基苯甲酸能够很好的结合在AsABCG28的TMD结构域上,结合自由能为-29.4036 kcal/mol;3-苯氧基苯甲酸羟基氧与AsABCG28的Val431形成氢键,键长为2.8 ?.
　　总之,本研究为了解ABC转运蛋白基因亚家族成员提供了基础信息框架,为更好地了解和深入研究ABC转运蛋白基因在溴氰菊酯抗性中的作用奠定了重要基础.AsABCG28基因与溴氰菊酯抗性密切相关,主要通过转运溴氰菊酯代谢产物3-苯氧基苯甲酸,减少其在体内的积累,从而提高蚊虫对溴氰菊酯的抗性.