论文部分内容阅读
无乳链球菌(Streptococcus agalctiae),亦称 B 群链球菌(Group B Streptococcus,GBS),具有广泛的宿主感染范围,不仅能引起新生儿脑膜炎及肺炎和奶牛乳腺炎,还可引致鱼类脑膜炎和败血症。近年来,无乳链球菌已成为鱼类重要致病菌之一,其传染性强,死亡率高,给水产养殖业造成惨重经济损失,严重制约了我国罗非鱼养殖业的稳定发展。研究发现,无乳链球菌对鱼类的致死率可达100%,但其致病机制尚不清楚。因此,研究其致病机制对防控鱼类无乳链球菌病至关重要。1鱼源无乳链球菌小鼠血脑屏障开放评估模型的建立本试验筛选出一株产β-半乳糖苷酶大肠杆菌M5,毒力测定得知其对小鼠半数致死量(LD50)>2×109CFU;各脏器细菌载量分析表明,该菌不能穿透血脑屏障(BBB)进入中枢神经系统,因此该菌可作为小鼠血脑屏障开放程度的指示菌。在此基础上,对小鼠腹腔注射l00μL浓度为103CFU/mL的无乳链球菌GD201008-001,并于注射后3h、6h、9h和12h,通过尾静脉注射大肠杆菌M5 100μL(2×108CFU),于5min后眼球采血并处死小鼠,无菌取脑,涂板计数。结果发现,脑组织中的无乳链球菌和大肠杆菌M5都随感染时间的延长而增加,证明该模型稳定性良好,为细菌性脑膜炎致病机制的研究提供了实用可靠的工具。2鱼源无乳链球菌透明质酸酶的表达及其对小鼠的致病作用为了确定透明质酸酶(hyaluronidase,Hyl)在鱼源无链球菌穿透血脑屏障引起脑膜炎过程中的作用,根据实验室分离并公布在GenBank上的罗非鱼源无乳链球菌的全基因组序列,设计hylB特异性引物,采用PCR技术扩增长为3156bp的hylB基因片段。用限制性内切酶EcoR Ⅰ和xho Ⅰ消化后将该片段克隆至表达载体pET32a(+),构建重组表达质粒pET32a(+)-hylB,经双酶切、测序鉴定后转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,进行体外原核表达,获得有透明质酸酶活性的137.1kD目的蛋白。经镍离子亲和层析柱纯化后,注射ICR小鼠,在不同时间点处死小鼠,无菌取心、肝、脾、肺、肾和脑制作病理切片,显微镜下观察到心、肝和肾无明显病变;脾脏表现轻微出血;肺组织病变严重,表现为血管破裂,内皮细胞松散,肺间质增厚,肺实变;脑组织有大量小胶质细胞浸润,脑微血管出血,血管内皮细胞肿胀脱落。研究表明,Hyl在鱼源无乳链球菌引致肺炎和破坏血脑屏障引起脑膜炎过程中发挥重要作用。3鱼源无乳链球菌cas9基因缺失株的构建为了明确cas9基因对无乳链球菌毒力的影响,根据公布在GenBank上的鱼源无乳链球菌GD201008-001株的基因组,设计cas9基因的上下游引物,通过PCR技术扩增其上下游片段,然后通过融合PCR方法融合扩增所得的上下游同源臂。将上下游同源臂连接至温敏型自杀质粒pSET-4s。通过电击转化将重组质粒转入GD201008-001株进行同源重组,通过抗性和温度筛选出cas9基因缺失株。将含有启动子的目的基因片段连入链球菌-大肠杆菌穿梭质粒pSET2,再转入缺失株,构建互补株。通过常规PCR、基因测序及荧光定量PCR检测目的基因在亲本株,缺失株和互补中的mRNA转录水平,证明cas9基因缺失株和互补株构建成功,为后续的生物学特性分析奠定了基础。4鱼源无乳链球菌cas9基因缺失株的特性分析为了进一步研究鱼源无乳链球菌cas9基因的功能,试验比较了野生株、缺失株和互补株在生物体内外的特性差异。研究发现,3株菌生长曲线无显著差异;小鼠巨噬细胞对cas9基因缺失株的吞噬率高于野生株和互补株,但差异不显著;相比于野生株和互补株,cas9基因缺失株对bEnd.3细胞的黏附率显著下降。缺失株对斑马鱼的LD50显著高于野生株和互补株;对小鼠的LD50有所升高,与野生株和互补株无显著差异,但小鼠死亡时间推迟12h。将培养至OD600约为0.6的3株菌(103CFU/mL)100μL及200μLHy1蛋白(2.0mg/mL)注射小鼠,分别在注射3h、6h、9h和12h后尾静脉注射大肠杆菌M5(2×108CFU),10min后眼球采血,并处死小鼠,无菌取脑,匀浆后10倍比稀释涂至THB和M63培养基平板。计数结果表明,3株菌在诱导BBB开放的时间上明显不同,感染野生株和互补株6h后小鼠BBB开放,而攻毒缺失株△cas99h后BBB开放;在攻毒后9h至12h,野生株和互补株攻毒组穿过BBB的无乳链球菌和大肠杆菌显著高于缺失株组。攻毒Hyl蛋白后,BBB在3h时已开放,在攻毒后6h至9h,蛋白组与3株细菌组穿过BBB的大肠杆菌无明显差异,而在12h时BBB开放程度显著低于野生株。研究结果表明cas9基因与无乳链球菌的毒力密切相关。