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目的:神经前体细胞表达发育下调基因4（Nedd4-2）,编码泛素连接酶E3。近期研究发现,部分癫痫患者中Nedd4-2基因发生突变,并指出Nedd4-2通过介导AMPA受体的亚基Glu A1的泛素化,影响神经元的活动和癫痫发作易感性。近年来研究表明,癫痫的发生与离子通道、神经递质、突触连接等有着密切联系。泛素化修饰的底物中有很多是影响中枢神经兴奋性的离子通道蛋白,泛素化修饰通过调控这些通道蛋白表达水平,进一步影响神经元的兴奋性,与癫痫的发生密切相关。然而是否还有其它未知与癫痫相关的Nedd4-2的底物有待进一步的研究。本研究利用CRISPR/Cas9技术,构建了Nedd4-2基因敲除（Nedd4-2+/-）小鼠模型,该模型中Nedd4-2长亚型和短亚型在脑中表达水平均减半。本研究通过戊四唑（PTZ）诱导实验组Nedd4-2+/-（KO）小鼠与对照组Nedd4-2+/+（WT）小鼠发生癫痫,采用Label-free蛋白组学检测和体内体外实验等方法,比较KO与WT小鼠海马组织蛋白质表达差异,以期发现新的Nedd4-2靶蛋白,揭示Nedd4-2参与癫痫发生的新机制。方法:1、Nedd4-2基因敲除小鼠由上海南方模式生物科技股份有限公司构建。2、小鼠每天给于PTZ 35mg/kg腹腔注射一次,癫痫发作评分按Racine分级。3、采用Label-free-LC-MS/MS技术检测PTZ诱导癫痫成功点燃的KO小鼠与WT小鼠海马体组织中的差异表达的蛋白质,并进行Cluster,GO和KEGG生物信息分析,筛选出与癫痫相关的差异蛋白。4、提取鼠尾DNA,PCR鉴定小鼠基因型。5、实时荧光定量PCR检测Nedd4-2和Kir4.1表达6、小鼠海马,皮质和髓质Western Blot检测Nedd4-2和Kir4.1的表达。7、尼氏染色检测小鼠脑组织中神经元数量的变化。8、免疫组织学方法检测Kir4.1在小鼠脑组织中的表达。9、Co-IP检测脑组织内Nedd4-2与Kir4.1以及Kir4.1与Ub的结合。10、细胞转染,Western Blot检测Nedd4-2和Kir4.1的表达,Co-IP验证转染后Kir4.1的泛素化程度变化。11、Kir4.1表达载体和突变载体转染细胞,Co-IP验证Nedd4-2与Kir4.1的结合。12、Kir4.1表达载体和Kir4.1突变体T312A转染细胞,给于放线菌酮（100μg/ml）处理,Western Blot检测Kir4.1表达变化。13、14-3-3表达载体转染细胞,给于R18处理,Western Blot检测Kir4.1表达变化,Co-IP验证Nedd4-2与Kir4.1的结合程度变化。14、Kir4.1表达载体分别和Nedd4-2表达载体或空载体共转染HEK293细胞,Kir4.1表达载体和Kir4.1突变体T312A分别转染HEK293细胞,记录Ba2+敏感的内向钾离子电流。结果:1、Rt-qPCR和Western Blot结果显示,KO小鼠与WT小鼠相比,Nedd4-2在海马,皮质和髓质m RNA和蛋白表达水平均下降约一半。2、小鼠经PTZ注射后,根据Racine评分标准,结果显示KO小鼠癫痫发作评分持续高于WT组。脑组织的尼氏染色结果显示,KO小鼠与WT对照组小鼠相比,尼氏体数量减少,说明神经元损伤更明显。3、海马体蛋白组学分析鉴定的3379个蛋白中,与WT小鼠对照相比,有55个蛋白被认为在KO小鼠中发生改变,其中内向整流k+通道Kir4.1上调了1.83倍。4、分别提取KO小鼠与WT小鼠海马、皮质和髓质总蛋白进行Western Blot实验,结果显示,与对照组WT小鼠相比,Nedd4-2表达明显降低（P<0.01）,Kir4.1表达明显增高（P<0.01）。5、免疫组化结果显示,KO小鼠与WT小鼠相比,Kir4.1表达升高。6、Co-IP结果显示,与WT组小鼠相比,KO小鼠海马中Kir4.1的泛素化修饰水平明显下调（P<0.01）。7、Co-IP实验证实,在KO与WT小鼠海马组织中,Nedd4-2与Kir4.1存在相互作用,另外,与WT组相比,KO组中Kir4.1与Nedd4-2结合程度明显减弱（P<0.01）。8、c6细胞转染Nedd4-2干扰载体,与对照组相比,Kir4.1蛋白表达升高。Co-IP结果显示,Kir4.1的泛素化水平明显降低。9、Kir4.1表达载体以及三种突变载体,分别和Nedd4-2共转染c6细胞,CoIP实验结果显示,Kir4.1突变体T312A与Nedd4-2相互作用明显减弱。10、T312A突变的Kir4.1表达载体和野生Kir4.1表达载体分别和Nedd4-2表达载体共转染c6细胞,给于Cycloheximide处理,与WT组相比,突变的Kir4.1仍保持较高水平（P<0.0001）。11、Co-IP结果显示,14-3-3与Kir4.1存在相互作用。c6细胞转染14-3-3表达载体,与空载组相比,Kir4.1表达水平降低,Kir4.1与Nedd4-2相互作用增强。相反,给于14-3-3抑制剂R18处理,与对照组相比,Kir4.1表达水平升高,Kir4.1与Nedd4-2相互作用增强。12、在HEK293细胞中,与空载体组相比,转染Nedd4-2表达载体的细胞中,Ba2+敏感的内向钾离子电流显著降低;与转染野生型Kir4.1表达载体相比,转染T312A突变体的Kir4.1 Ba2+敏感的内向钾离子电流为野生型3.5%。结论:1、在PTZ诱导癫痫的KO和WT小鼠海马组织中,共鉴定到3379个蛋白质,筛选出了55个差异蛋白,与WT组相比,在KO组中21个高表达13个低表达。2、Nedd4-2单倍剂量不足引起癫痫易感性升高。3、Nedd4-2是Kir4.1的泛素E3连接酶,Nedd4-2通过与Kir4.1的苏氨酸312-脯氨酸这一基序相互作用,并介导其发生泛素化修饰和降解。4、KO小鼠脑组织中,Kir4.1表达明显上调,Kir4.1泛素化修饰水平下调。5、适配器蛋白14-3-3促进了Nedd4-2介导的Kir4.1的泛素化。