A型塞内卡病毒(SenecaviruaA,SVA)属于小RNA病毒科、塞内卡病毒属,能引起各日龄的猪群出现类似口蹄疫等水泡性疾病样临床症状,并造成新生仔猪急性死亡,严重危害我国养猪业的发展。由于塞内卡病毒病是一种新发的传染病,以往的研究主要集中在其生物学特性上,而关于SVA疫苗、侵入机制和免疫机理等方面的研究甚少。VP1、VP2和VP3是SVA表面的结构蛋白,其既包含介导病毒入侵宿主细胞的受体结合域,也包含激发机体免疫应答产生中和抗体的抗原表位。因此,本研究对SVA这3个结构蛋白的B细胞抗原表位进行了筛选与鉴定,为SVA的病原学、诊断方法、抗原结构和新型表位疫苗的研究奠定了基础。本实验室前期利用分离获得的SVA田间流行毒株CH-FJ-2017制备了SVA灭活疫苗,并以此免疫猪群,获得免疫血清SOW6-1、PC6-2和PC4-3。本研究首先对3个免疫血清的生物学特性进行了分析鉴定。间接ELISA试验结果表明这些免疫血清与SVA的结构蛋白均具有良好的亲和性,WesternBlotting(WB)和间接免疫荧光试验(IndirectImmunofluorescenceAssay,IFA)结果表明这些血清与SVA及其结构蛋白均具有良好的免疫反应性,病毒中和试验(VirusNeutralizationTest,VNT)结果表明这些血清对SVA流行毒株的中和效价大于1024。然后结合生物信息学预测法和交叠多肽生物合成法,并利用免疫血清对SVA3种结构蛋白的B细胞抗原表位进行了筛选与鉴定。通过Protparam和PSIPRED在线软件对这3种结构蛋白的理化特性和二级结构进行分析。利用Bcepred、ABCpred、Bepipred、IEDB、SVMpred、Ellipro和SEPPA2.0等7种生物信息预测软件,对各结构蛋白的B细胞抗原表位进行综合分析。合成预测的抗原表位,并通过ELISA试验进行验证。最终在VP1、VP2和VP3蛋白上分别鉴定出3、6和3个B细胞抗原表位。为进一步提高鉴定的准确性,基于这3种结构蛋白的氨基酸序列,构建96个带GST188标签的交叠16肽,相邻交叠多肽之间重叠8个氨基酸残基,并将这些肽段克隆至pXXGST-1原核表达载体,进行大肠杆菌表达。通过WB试验分析这些交叠多肽与血清的免疫反应性,最终在VP1、VP2和VP3蛋白上分别鉴定出7、13和5个阳性片段。最后对筛选的B细胞抗原表位进行了免疫原性分析。根据以上两种方法的筛选结果,选择并合成两种方法鉴定一致性较好的抗原表位,将这些抗原表位分别与钥孔血蓝蛋白(KLH)偶联,并通过豚鼠免疫试验制备血清。这些免疫血清与SVA结构蛋白具有良好的免疫反应性和较高的亲和力,且能特异性识别IBRS-2细胞中感染的SVA。综上所述,本研究鉴定出SVAVP1蛋白2个线性B细胞抗原表位VP1-1(6-21aa)和VP1-2(221-233aa),VP2蛋白4个线性B细胞表位VP2-1(5-16aa)、VP2-2(35-57aa)、VP2-3(175-187aa)和VP2-4(267-282aa),VP3蛋白1个线性B细胞抗原表位VP3-1(135-153aa),并且这些表位都具有能激发机体免疫应答的能力,为进一步研究VP1、VP2和VP3蛋白的功能、诊断方法和新型SVA表位疫苗的研究奠定了基础。