快速的工业化已导致全球氮循环失衡,由于哈伯-波希制氨法大幅提升了食品生产,固氮的速度已超过反硝化速度,从而导致有害的环境影响,尤其是海洋生态系统的污染以及大气中温室气体氧化亚氮浓度的增加。目前减缓环境污染的主要策略包括提高反硝化速度,以保持固氮和反硝化之间的平衡。亚硝酸还原酶能够催化亚硝酸还原为一氧化氮气体,从而有助于反硝化过程含铜亚硝酸还原酶（CuNiR）通过从T1-铜到T2-铜的分子内电子转移催化亚硝酸还原,但由于理论和实验研究之间的分歧,含铜的亚硝酸还原酶（CuNiR）的催化机理仍存在诸多疑问,主要包括活性中心第二层氨基酸Asp98和His255任何调控质子电子转移,以及对T1-铜到T2-铜电子转移的微观机制。之前绝大多数理论研究将电子转移和质子转移看作分离反应步骤处理,这与最近实验认为的质子耦合电子转移（PCET）机理有矛盾。基于亚硝酸还原酶催化机理的争议问题,我们使用基于量子力学/分子力学的（QM/MM）水平下的metadynamics自由能计算（标记为QM/MM-MetD）重新考察了A.faecalis中铜依赖亚硝酸还原酶（A.faecalis CuNiR）催化机理。该方法不仅可以在原子水平上准确描述催化反应,还能够在包含酶环境效应以及酶动态过程下计算整个反应的自由能。我们研究中得到的主要结果如下:1.关于Asp98和His255的质子化状态,我们研究表明只有当两个残基都质子化状态下才能导致还原反应的进行。另外,QM/MM-MetD模拟得到的两个残基同时质子化状态下的活性区间结构和晶体结构很好吻合。2.关于电子供体T1-铜以及残基His135和Cys136在还原反应的重要性,模拟显示只有把电子供体包进QM区才能导致亚硝酸还原的进行。在没有T1-铜的情况下,反应在热力学以及动力学角度都不可行。因此,进一步分析显示His135和Cys136残基直接调控T1-铜到T2-铜的分子内电子转移反应。3.亚硝酸还原以非同步质子耦合电子转移（asynchronous PCET）发生,从T1-铜到T2-铜的分子内电子转移先于从Asp98到亚硝酸的质子转移,而Asp98构型的变化是引发电子转移的关键因素。计算的自由能势能面表明总能垒的绝大部分由Asp98从关守构型（gatekeeper）到近端（proximal）的构型变化贡献,从后续PCET过程本身动力学很容易。4.我们首次考察了电子供体T1-铜对亚硝酸还原过程的影响,并提出对亚硝酸还原酶新的催化机理。另外,基于QM/MM-MetD模拟发现第二步产物生成直接通过HO-NO键裂解进行,同时形成产物态T2-Cu（Ⅱ）-OH-。我们研究结果表明,在研究与PCET等电子转移相关的过程中,将电子供体包含在QM区域处理将能够合理描述电子转移相关过程。该研究有助于CuNiR酶的设计改造,并且有助于开发基于CuNiR酶的生物感测器。