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目的:以DPN血瘀证人群为研究对象,采用回顾性分析的方法,筛选出DPN血瘀证的临床危险因素;基于临床研究结果,利用高通量测序技术结合生物信息学方法,分析DPN血瘀证人群外周血m RNA和lnc RNA差异表达谱,综合探讨DPN血瘀证临床危险因素和生物学标志物,为DPN中医分证诊疗提供理论和实验依据,以期实现中医病证的精准治疗。方法:第一部分采用病例对照研究设计,收集纳入532例DPN患者的临床资料,分析DPN血瘀证人群的临床特征,运用Lasso回归方法对DPN血瘀证临床特征进行初步筛选,运用Logistic回归分析对DPN血瘀证的影响因素进行单因素和多因素分析,筛选出DPN血瘀证的临床危险因素。最后通过区分度检验、校准度检验和决策曲线分析,综合评价危险因素的信效度。第二部分选取DPN血瘀证患者(A)、DPN非血瘀证患者(D)和健康对照组(C)各4例,分别提取外周血单个核细胞(PBMCs),利用高通量测序平台检测m RNA和lnc RNA的表达情况,应用生物信息学方法,筛选出差异表达的m RNA/lnc RNA,构建差异表达m RNA的PPI网络和hub基因,对差异表达lnc RNA进行靶基因预测,构建lnc RNA-m RNA共表达网络。同时,进一步分析差异m RNA和lnc RNA涉及的信号通路和生物学过程,发现DPN血瘀证发生发展过程相关的核心m RNA和lnc RNA。第三部分针对第二部分综合分析的结果,筛选出DPN血瘀证相关的核心m RNA和lnc RNA,扩大样本量进行验证,采用2-△△CT法计算目标基因的相对表达量;采用Pearson相关分析核心m RNA和lnc RNA与临床理化指标之间的相关性;采用一般线性回归分析核心m RNA和lnc RNA与DPN血瘀证的相关性;通过ROC曲线的AUC面积评价核心m RNA和lnc RNA在DPN血瘀证中的诊断价值。结果:第一部分(1)Lasso回归分析结果显示最佳lambda产生了20个具有非零系数的变量,分别是年龄、BMI、糖尿病病程、糖尿病视网膜病变并发症、脑梗死并发症、收缩压(SBP)、舒张压(DBP)、空腹血糖(FPG)、餐后两小时血糖(2HPG)、糖基化血红蛋白(Hb A1c)、甘油三酯(TG)、总胆固醇(T-CHOL)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、血红蛋白(HGB)、血小板计数(PLT)、凝血酶原时间(PT)、部分凝血酶原时间(APTT)、纤维蛋白原(FBG)、凝血酶时间(TT)、血沉(ESR)。(2)单因素Logistic回归分析,结果共筛选出11个变量与DPN血瘀证的发生有关,分别是糖尿病病程、餐后两小时血糖(2HPG)、糖基化血红蛋白(Hb A1c)、甘油三酯(TG)、总胆固醇(T-CHOL)、血红蛋白(HGB)、血小板计数(PLT)、凝血酶原时间(PT)、部分凝血酶原时间(APTT)、纤维蛋白原(FBG)、血沉(ESR)。(3)多因素Logistic回归分析结果显示8个变量与DPN血瘀证的发生相关,分别是糖尿病病程(OR:1.06,95%CI:1.02-1.09)、糖基化血红蛋白(OR:1.40,95%CI:1.24-1.59)、甘油三酯(OR:1.62,95%CI:1.32-1.98)、血小板计数(OR:1.01,95%CI:1.00-1.01)、凝血酶原时间(OR:0.41,95%CI:0.32-0.51)、部分凝血酶原时间(OR:0.67,95%CI:0.59-0.77)、纤维蛋白原(OR:3.67,95%CI:2.50-5.40)、血沉(OR:1.03,95%CI:1.00-1.07)。(4)区分度检验、校准度检验和决策曲线分析结果显示包含糖尿病病程、糖基化血红蛋白、甘油三酯、血小板计数、凝血酶原时间、部分凝血酶原时间、纤维蛋白原和血沉在内的8个变量具有良好的特异度、敏感度和临床净获益率,具有较好的预测能力,可为DPN血瘀证风险评估提供重要依据。第二部分(1)以q-value<0.05,|log2FC|≥2为阈值标准,筛选出各组差异表达m RNA和lnc RNA,通过DPN血瘀证与健康对照比较,共获取980个差异m RNA,其中上调m RNA数为593个,下调m RNA数为397个;共获取1648个差异lnc RNA,其中上调lnc RNA数为997个,下调lnc RN数为651个。通过DPN血瘀证和非血瘀证对照,共获取615个差异m RNA,其中上调m RNA数为380个,下调m RNA数为235个;共获取1026个差异lnc RNA,其中上调lnc RNA数为678个,下调lnc RNA数为348个。选取两个基因集的共同的部分,联合分析最终筛选出DPN血瘀证相关的差异表达基因谱。共获取396个差异m RNA,其中281个上调m RNA,115个下调m RNA;413个差异lnc RNA,其中上调lnc RNA数有290个,下调lnc RNA数为123个。(2)差异表达的m RNA共参与274个生物过程(BP)、23个细胞成份(CC)、34个分子功能(MF)和90条显著富集的KEGG通路。差异表达的lnc RNA共参与364个生物过程(BP)、118个细胞成份(CC)、19个分子功能(MF)和29条显著富集的KEGG通路。差异lnc RNA和差异m RNA共同参与163个生物过程(BP)、25个细胞成份(CC)、38个分子功能(MF)和25条显著富集的KEGG通路。(3)差异表达的m RNA与lnc RNA共同主要参加了对细胞来源的小分子的反应、对脂多糖的反应、中性粒细胞活化、由中性粒细胞介导的免疫、中性粒细胞脱颗粒、参与免疫过程的中性粒细胞活化等生物过程。主要富集于细胞特异性颗粒、特异性颗粒管腔、细胞质囊泡腔、囊泡腔、三级粒细胞腔等细胞构成部位。主要参加了巯基红蛋白的结合、载氧体活力、过氧化酶活力、氧化还原酶活力,以及过氧化物为接受器所产生的等分子作用。主要富集在IL-17信号通路、细胞因子-细胞因子受体相互作用、疟疾、类风湿关节炎、癌症中的转录失调、病毒蛋白与细胞因子和细胞因子的相互作用、NF-κB信号通路、TNF信号通路、脂质和动脉粥样硬化等信号通路。(4)通过综合分析,结果显示IL6、MMP9、CXCL1、CXCL10、MMP8、CAMP、CXCL8和TLR4是调控网络中的核心m RNA,MEG3、MALAT1、XIST、AC087239.1、AC00766.1和AC009088.1是调控网络中的核心lnc RNA,这些基因可能作为DPN血瘀证基因层面生物标志物,需要进一步的实验验证。第三部分(1)最终筛选出3个lnc RNA和3个m RNA进行扩大样本量验证。结果显示,与健康对照组(C)相比,DPN血瘀证组(A)患者MEG3、MALAT1、IL-6、MMP9和CXCL1表达升高,XIST表达降低,差异有统计学意义(P(27)0.05)。与DPN非血瘀证组(D)相比,DPN血瘀证组(A)患者MEG3、MALAT1、IL-6、MMP9和CXCL1表达升高,XIST表达降低,差异有统计学意义(P(27)0.05)。RT-q PCR与高通量测序的表达结果一致。验证了MEG3、MALAT1、XIST、IL-6、MMP9和CXCL1在DPN血瘀证的发生发展中具有重要作用。(2)将MEG3、MALAT1、XIST、IL-6、MMP9和CXCL1与研究一中筛选出的危险因素进行相关性分析,发现MEG3的相对表达量与糖基化血红蛋白(Hb A1c)和纤维蛋白原(FBG)呈正相关,与凝血酶原时间(PT)和部分凝血酶原时间(APTT)呈负相关。MALAT1的相对表达量与糖尿病病程、糖基化血红蛋白(Hb A1c)、甘油三酯(TG)和纤维蛋白原(FBG)呈正相关。XIST的相对表达量与部分凝血酶原时间(APTT)呈正相关,与糖基化血红蛋白(Hb A1c)呈负相关。IL-6的相对表达量与糖尿病病程、糖基化血红蛋白(Hb A1c)、甘油三酯(TG)、纤维蛋白原(FBG)和血沉(ESR)呈正相关,与部分凝血酶原时间(APTT)呈负相关。MMP9的相对表达量与糖尿病病程、糖基化血红蛋白(Hb A1c)、甘油三酯(TG)、血小板计数(PLT)、纤维蛋白原(FBG)和血沉(ESR)呈正相关。CXCL1与糖基化血红蛋白(Hb A1c)呈正相关,与凝血酶原时间(PT)呈负相关。(3)MEG3、MALAT1、XIST、IL-6、MMP9和CXCL1与DPN血瘀证的回归分析发现MEG3、MALAT1、XIST、IL-6和MMP9与DPN血瘀证的危险程度具有统计学意义。按OR值影响因素大小排列:MMP9(OR:1.78,95%CI:1.21,2.62)IL-6(OR:1.51,95%CI:1.09,2.08)、MALAT1(OR:1.27,95%CI:1.06,1.52)、MEG3(OR:1.16,95%CI:1.00,1.35)、XIST(OR:0.02,95%CI:0.00,0.26)。(4)ROC受试者工作特征曲线表明MEG3的AUC面积为0.7297,特异度为78.26%,灵敏度为73.91%。MALAT1的AUC面积为0.8639,特异度为78.26%,灵敏度为78.26%。XIST的AUC面积为0.9244,特异度为78.26%,灵敏度为95.65%。IL-6的AUC面积为0.9433,特异度为100%,灵敏度为91.30%。MMP9的AUC面积为0.8110,特异度为65.22%,灵敏度为86.96%。CXCL1的AUC面积为0.7410,特异度为60.87%,灵敏度为82.61%。论:(1)糖尿病病程延长、糖基化血红蛋白、甘油三酯、血小板计数、凝血酶原时间、部分凝血酶原时间、纤维蛋白原和血沉的异常可能是诱发DPN血瘀证的重要指标。DPN血瘀证的发生发展与病程、血糖血脂、血小板功能、凝血功能、免疫炎症等因素相关,是多种因素综合作用的结果。(2)DPN血瘀证患者外周血存在大量差异表达的m RNA和lnc RNA,其富集通路和生物学过程多涉及炎症反应、免疫反应以及细胞因子和细胞因子的相互作用,提示炎症及免疫反应可能在某种程度上介导和参与DPN血瘀证的发生发展过程。(3)MEG3、MALAT1、XIST、IL-6、MMP9和CXCL1是DPN血瘀证的关键基因,可能作为DPN血瘀证的候选生物标志物。