目的本课题对前期合成的中药甘草活性成分甘草次酸的衍生物进行活性筛选,分别探讨候选化合物靶向HMGB1在脓毒症炎症风暴时期和免疫抑制时期的治疗作用及机制。方法1.首先通过CCK-8法检测中药活性成分甘草次酸衍生物自身的细胞毒性;Griess法和流式细胞术检测衍生物对NO、TNF-α和IL-6的抑制效果,初步得到五个候选化合物;进一步在LPS的刺激下,检测候选化合物的细胞毒性和细胞凋亡情况,最终得到候选化合物GA-62T;通过计算机模拟分子对接技术和表面等离子共振技术评价GA-62T与HMGB1的亲和力。2.候选化合物GA-62T体外的代谢稳定性进行评价:对GA-62T在人（HLM）、大鼠（RLM）和小鼠（MLM）肝微粒体体系代谢特点进行了初步研究,采用LC-MS/MS技术,建立了灵敏、特异的测定GA-62T浓度的分析方法;进行了GA-62T体外代谢稳定性实验。3.候选化合物GA-62T在脓毒症炎症风暴时期体内活性评价,分别从LPS/CLP诱导的两种小鼠急性脓毒症模型进行生存率、血浆炎性因子TNF-α和HMGB1水平、肺脏和肾脏的损伤程度进行评价;探讨GA-62T改善脓毒症炎症风暴的可能机制,分别从MAPK和NF-κB信号通路进行评价;探讨GA-62T对HMGB1释放的影响和可能的机制。4.在单核巨噬细胞中,考察GA-62T对LPS/HMGB1慢性诱导的PD-L1表达的影响;构建体外T淋巴细胞免疫抑制的模型,评价GA-62T对T淋巴细胞的增殖、凋亡、周期及功能的影响;在CLP-白色念珠菌“二次打击”诱导的脓毒症免疫抑制模型中,分别从生存率、血浆细胞因子TNF-α和IFN-γ水平、肾脏白色念珠菌清除率评价GA-62T的保护作用;探讨GA-62T通过HMGB1/PKM2/STAT1信号通路抑制PD-L1表达的可能机制。结果1.中药活性成分甘草次酸衍生物的细胞毒性普遍较低,NO抑制率在10μM时达到90%以上,依据TNF-α和IL-6抑制率筛选得到五个初步的候选化合物:GA-21T、GA-51T、GA-53T、GA-62T和GA-68T;通过进一步的细胞活性和细胞凋亡检测,最终得到细胞毒性小,抗炎效果好,同时在LPS刺激下细胞活性未降低,凋亡未增加的甘草次酸衍生物GA-62T;GA-62T与HMGB1直接结合,并且其与HMGB1相结合能力优于甘草酸和甘草次酸。2.根据肝微粒体代谢稳定性结果推测:GA-62T在人体内属于低清除药物,在大鼠、小鼠体内均属于中等清除药物。3.候选化合物GA-62T可以提高LPS/CLP诱导的小鼠急性脓毒症模型生存率,降低血浆炎性因子TNF-α和HMGB1的水平,改善肺脏和肾脏的损伤程度;GA-62T可以抑制HMGB1的释放,但不影响HMGB1在细胞内的分布;GA-62T可能通过与HMGB1结合,下调MAPK的P38、ERK和JNK以及NF-κB信号通路的P65和IKKα/β磷酸化水平来达到抗炎效果。4.候选化合物GA-62T可能通过下调PKM2和STAT1来降低单核巨噬细胞中PD-L1的表达水平;在体外T细胞免疫抑制模型中,GA-62T可以改善T淋巴细胞的增殖、凋亡、周期及功能;GA-62T可以改善小鼠脓毒症免疫抑制模型的生存率,降低血浆炎性因子TNF-α水平,升高IFN-γ,并提高肾脏对白色念珠菌的清除率。结论本课题表明前期合成的中药活性成分甘草次酸衍生物有较好的抗炎活性,候选化合物GA-62T与HMGB1结合能力优于甘草酸与甘草次酸。GA-62T可以显著提高LPS/CLP诱导的小鼠急性脓毒症模型和CLP-白色念珠菌“二次打击”诱导的小鼠脓毒症免疫抑制模型的存活率。在机制方面,GA-62T靶向HMGB1,可能通过调控经典的MAPK和NF-κB信号通路达到抗炎效果,可能通过调控HMGB1/PKM2/STAT1信号通路达到调节免疫的效果。GA-62T为脓毒症的临床用药提供了更多的选择,且脓毒症炎症风暴时期和免疫抑制时期均可选用,为中药活性成分治疗脓毒症提供新的实验数据,为寻找新型基于中药活性成分HMGB1抑制剂的先导化合物提供了新的依据。