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背景随着世界人口的日益老龄化,老年性的疾病,特别骨质疏松症(Osteoporosis,OP)的发病率也呈现同步增长的趋势。生理条件下的骨代谢是骨质吸收和形成的动态平衡,各种原因引起的吸收过多和形成不足导致平衡破坏,使得骨量减少,发生骨质疏松。对骨质疏松疾病的治疗在医疗上一直备受关注,治疗原则主要包括减慢骨质的丢失和恢复已丢失的骨量。临床上主要治疗包括矿化类制剂、骨吸收抑制药物、骨形成促进药物等,可缓解症状,预防骨折等并发症,但药物治疗常常会带来一些副作用,不利于患者的健康。因此,针对骨质疏松新型治疗方法的研究,一直是骨科领域的热点。破骨细胞(Osteoclast,OC)是参与骨代谢平衡的主要细胞,破骨细胞的激活是导致骨质疏松的重要原因,因此,该过程中的分子发生机制成为近年来骨生理病理及骨相关疾病实验研究的重点对象。已有实验研究表明,RANKL/RANK/OPG信号轴是破骨细胞分化过程中的重要信号调节通路,由于这些信号的发生使得细胞下游的信号发生改变,如Src的激活,从而影响细胞的功能。Akt/mTOR信号通路可能是Src通路的下游分子,RANKL作用于破骨细胞前体细胞,可能使得Src蛋白激活,其下游的Akt及mTOR蛋白分子也可能被激活,引起后续信号改变,最终使得破骨细胞的分化。脉冲电磁场(pulsed electromagnetic fields,PEMFs)作为一种新型物理治疗手段,已被用于骨质疏松治疗的研究,具有无创、低成本、简单易行等优势。脉冲电磁场可能影响细胞的增殖、凋亡和分化等。一些实验表明脉冲电磁场可以抑制破骨样细胞的分化,可能有利于骨质疏松的治疗,但是具体的机制尚不明确。本研究中应用破骨细胞分化因子(Receptor activator of nuclear factor-KB ligand,RANKL)诱导RAW264.7巨噬细胞建立体外的破骨细胞分化模型,旨在探讨脉冲电磁场对RAW264.7巨噬细胞向破骨细胞分化的影响,同时,根据细胞信号传导通路,探讨脉冲电磁场是否通过Akt/mTOR信号通路影响破骨细胞分化,进一步明确脉冲电磁场的作用机制。目的1.脉冲电磁场能否抑制RANKL诱导的RAW264.7巨噬细胞向破骨细胞分化。2.脉冲电磁场是否通过调节Akt/mTOR信号通路抑制RAW264.7巨噬细胞向破骨细胞分化。材料和方法1.采用CCK-8试剂盒检测各种刺激因素对RAW264.7巨噬细胞增殖活性的影响;2.体外条件下使用RANKL诱导培养RAW264.7巨噬细胞向破骨细胞分化,或加入PEMF照射,培养相应时间,进行细胞形态学、功能、标志基因和蛋白的检测,进行TRAP染色、骨片吸收实验甲苯胺蓝染色、RT-qPCR及蛋白免疫印迹实验;3.探索细胞内信号的改变,RAW264.7巨噬细胞加入RANKL刺激后,再加用脉冲电磁场或Akt、mTOR蛋白的特异性抑制剂,Western blot检测Akt、mTOR蛋白表达的改变。结果实验结果表明各种刺激因素本身对于细胞的增殖活性没有明显影响;RAW264.7细胞经RANKL诱导培养后,TRAP染色显示的阳性破骨细胞形成明显增加,甲苯胺蓝染色显示骨吸收陷窝也明显增多,但是同时施加脉冲电磁场刺激后,破骨细胞形成和骨吸收陷窝明显减少;同时,PEMF刺激抑制破骨细胞标志基因和蛋白的表达水平;Western blot结果表明RANKL可以激活细胞内的Akt、mTOR、p70S6K蛋白,促进蛋白的磷酸化,但是同时施加脉冲电磁场或蛋白的特异性抑制剂哌立福辛(perifosine,Akt抑制剂)和雷帕霉素(rapamycin,mTOR抑制剂)可以明显减弱这三种蛋白的磷酸化。结论1.脉冲电磁场抑制RANKL诱导的RAW264.7巨噬细胞向破骨细胞分化,同时抑制其骨吸收活性。2.脉冲电磁场通过抑制RANKL激活的Akt/mTOR信号通路,抑制RAW264.7巨噬细胞的破骨细胞分化。