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目的骨骼肌是机体葡萄糖代谢的主要器官,运动促进骨骼肌摄取和利用葡萄糖。葡萄糖转运子4(GLUT4)是骨骼肌细胞膜上介导葡萄糖跨膜转运的蛋白质,运动促进GLUT4从胞浆转位到细胞膜上促进骨骼肌摄取葡萄糖,对胰岛素抵抗和2型糖尿病的治疗有重要意义,但相关的分子机制仍不清楚。我们发现电脉冲刺激骨骼肌细胞收缩磷酸化Akt,本研究探讨电脉冲刺激激活Akt的分子机制。内容本课题分三部分:第一部分,应用电刺激诱导C2C12-GLUT4HA肌管收缩,检测电刺激对GLUT4转位以及Akt磷酸化水平的影响。加入Akt抑制剂,检测电刺激对GLUT4转位、Akt磷酸化及TBC1D4磷酸化的影响。第二部分,通过抑制剂和(或)激活剂以及si RNA的方法,抑制或激活AMPK或Rac1,探讨电刺激条件下AMPK、Rac1与Akt之间的关系。第三部分,选取8~10周龄的C57BL/6小鼠,分别给予胰岛素、AMPK激活剂AICAR、激活型AMPK腺病毒及运动跑台处理,在动物水平上研究运动及AMPK对骨骼肌Rac1和Akt的调节作用。方法培养C2C12-GLUT4HA骨骼肌细胞,使其分化为成熟的可收缩的肌管,20V,1 Hz,24 ms电脉冲刺激1h。酶联免疫吸附法(ELISA)测定细胞膜上GLUT4的水平。应用化学性抑制剂和(或)激活剂,抑制或激活AMPK、Rac1,应用si RNA方法下调Rac1表达,研究电刺激作用下AMPK、Rac1、Akt之间的关系。选取8~10周龄的C57BL/6小鼠,随机分为对照组、胰岛素组、AICAR组、AMPK激活型腺病毒组和跑台组,检测骨骼肌中Rac1活性和Akt磷酸化,探讨不同作用条件对Rac1活性及Akt磷酸化的影响。结果1.电刺激促进C2C12-GLUT4HA骨骼肌肌管GLUT4转位,升高Akt的磷酸化。Akt抑制剂降低电刺激诱导的Akt及其底物TBC1D4的磷酸化,并抑制电刺激促进的GLUT4转位,表明Akt介导电刺激诱导的GLUT4转位的作用。2.电刺激和AICAR均增加Rac1的活性,AICAR还激活Akt;AMPK抑制剂Compound C抑制电刺激及AICAR增加PAK及Akt磷酸化的作用;si Rac1及Rac1 inhibitorⅡ均抑制电刺激及AICAR增加Akt磷酸化的作用,提示电刺激可能通过AMPK-Rac1信号通路激活Akt。3.在C57BL/6小鼠中,AICAR、AMPK激活型腺病毒以及运动跑台均增加骨骼肌Rac1的活性和升高Akt的磷酸化。结论AMPK-Rac1信号通路介导电脉冲刺激激活C2C12-GLUT4HA骨骼肌细胞Akt的作用。