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目的:基于课题组已获得的研究结果,二甲基亚硝胺大鼠腹腔注射造模2周时,形成典型的肝纤维化,持续造模至4周末有75%大鼠已形成典型的肝硬化,在造模2周后,即第3周开始给于不同功效的古典方剂至4周末,结果表明。茵陈蒿汤可显著抑制大鼠硬化的形成,黄芪汤具有一定效应,而一贯煎、下瘀血汤及小柴胡汤则无明显作用。本文在此基础上采用蛋白质组学技术,探讨不同功效方剂干预二甲基亚硝胺肝硬化大鼠肝组织的蛋白质组效应基础。
方法:采用双向凝胶电泳技术分离正常组、2周模型组、4周模型组、茵陈蒿汤组、一贯煎组、黄芪汤组、下瘀血汤组、小柴胡汤组肝组织总蛋白质,获得的2-D凝胶采用考马斯亮蓝显色、通过ImageScanner扫描仪扫描获取图像,再经ImageMaster6.02D Platinum软件进行图像分析并识别差异蛋白点,采用MALDI-TOF/TOF-MS质谱技术和Mascot搜索软件鉴定差异蛋白质,并在SWISS-PROT和NCBI蛋白质数据库中确定所鉴定的蛋白质的功能。
结果:
1、双向凝胶电泳图谱的建立
建立了正常组、2周模型组、4周模型组、茵陈蒿汤组、一贯煎组、黄芪汤组、下瘀血汤组、小柴胡汤组大鼠肝组织总蛋白质的2-DE图谱。各组大鼠肝组织检测到的平均蛋白质点数分别为:正常组1128个,2周模型组1113个,4周模型组1130个,茵陈蒿汤组1115个,黄芪汤组1132个,下瘀血汤组1135个,一贯煎组1127个,小柴胡汤组1037个。与参考胶匹配率分别为:78.15%、81.22%、82.65%、80,18%、83,23%、78.94%、79.64%0
2、差异蛋白点
与正常组比较,2周模型组有78个蛋白质点上调,有89个蛋白质点下调;4周模型组有59个蛋白质点上调,有113个蛋白质点下调。
与4周模型组比较,茵陈蒿汤组有60个蛋白质点上调、56个蛋白质点下调,黄芪汤组有51个蛋白质点上调、90个蛋白质点下调,小柴胡汤组有48个蛋白质点上调、33个蛋白质点下调,一贯煎组有57个蛋白质点上调、74个蛋白质点下调,下瘀血汤组有62个蛋白质点上调、98个蛋白质点下调。
3、差异蛋白质的质谱鉴定及其在各组中的表达情况
筛选出50个差异蛋白点做质谱鉴定。已知功能明确的蛋白质44个。
(1)与正常组比较,模型组中表达上、下调的蛋白分别有21、22个,功能涉及氧化应激及线粒体氧化磷酸化(谷胱甘肽S-转移酶、DJ-1 protein、铜/锌超氧化物歧化酶、谷胱甘肽合成酶、醛酮还原酶7A2、泛醌细胞色素c还原酶铰链蛋白、24-kDa线粒体NADH脱氢酶前体)、细胞骨架(原肌球蛋白4、原肌球蛋白5、加帽蛋白α2、γ肌动蛋白、层粘连蛋白受体1、细胞角蛋白8、细胞角蛋白18)、细胞增殖与凋亡(热反应蛋白12、翻译控制肿瘤蛋白1、MAWDBP、蛋白酶体亚基α5、26S蛋白酶调节亚基6A)、神经系统发育(唐氏综合症临界区域基因1-1蛋白、神经肿瘤抗原-1、脑脂结合蛋白)、神经传导(儿茶酚邻甲基转移酶抑制剂、γ-氨基丁酸受体p2亚基)、基因表达调控(转录调节因子1-β、翻译延伸因子1-β)、物质转运(白蛋白、α-2u球蛋白、α-2u-球蛋白前体)、物质代谢(亮氨酸氨基肽酶、二甲基精氨酸氨基水解酶1、精胺脲水解酶、2-氧异戊酸脱氢酶亚基α、半乳糖激酶1、果糖-1,6-二磷酸酶1、前列腺素还原酶、促肥大反应蛋白)、免疫与炎症(补体衰变加速因子、二肽基肽酶I)、生物转化(磺基转移酶1C1、D-多巴色素异构酶)等。
(2)茵陈蒿汤对模型组有显著调节作用的蛋白质,主要涉及细胞增殖与凋亡(热反应蛋白12、唐氏综合症临界区域基因1-1蛋白、神经肿瘤抗原-1、翻译控制肿瘤蛋白1、MAWDBP)、氨基酸代谢(支链酮酸脱氢酶E1、精胺脲水解酶、亮氨酸氨基肽酶、翻译延伸因子)、氧化应激(醛酮还原酶7A2,DJ-1蛋白,铜/锌超氧化物歧化酶)等功能,
(3)黄芪汤对模型组有显著调节作用的蛋白质,主要涉及细胞分化(转录调节因子1β、脑脂结合蛋白),神经传导(γ-氨基丁酸受体p2亚基、儿茶酚邻甲基转移酶抑制剂)、细胞骨架(原肌球蛋白4、原肌球蛋白5、γ肌动蛋白、细胞角蛋白18)、脂糖代谢(促肥大反应蛋白、半乳糖激酶1、果糖-1,6-二磷酸酶1)、氧化应激(谷胱甘肽S-转移酶Yb-1亚基,DJ-1蛋白,铜/锌超氧化物歧化酶)等功能。
结论:
(1)二甲基亚硝胺大鼠肝硬化形成的病理生物学变化主要表现为氧化应激与线粒体的损伤,肝内细胞的增殖、分化及凋亡的异常,神经递质、脂类、糖类代谢的异常以及蛋白质、氨基酸代谢的降低等诸多环节;
(2)调控细胞的异常增殖与凋亡以及抗氧化应激损伤是茵陈蒿汤抑制DMN大鼠肝硬化形成,改善蛋白质、氨基酸代谢的效应基础;
(3)抑制细胞异常分化、抗氧化应激及线粒体损伤是黄芪汤减缓肝纤维化进程,改善神经递质、脂肪及糖代谢异常的主要作用环节。