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蝴蝶兰(Phalaenopsis)素有“洋兰皇后”的美誉,但现今的扩繁技术远无法满足市场需求,而组织培养中的褐变问题严重影响了快速繁殖的成功率。普遍认为,苯丙氨酸解氨酶(PAL)、多酚氧化酶(PPO)、过氧化物酶(POD)等参与褐变过程。前期研究发现,POD和PPO的活力在接种后都有显著增加,特别是离体培养3d后,而PAL,酶活随着褐变加剧而增加,因此推断前者参与褐变的启动,后者与褐变进程相关。获取外植体的剪切过程引起外植体氧化爆发,从而引起组织内ROS水平失衡,有可能引发组织褐变,并最终导致细胞死亡。本研究以蝴蝶兰叶片在褐变加重(儿茶酚处理)和减轻(柠檬酸处理)处理情况下,分析外植体褐变细胞内ROS水平变化。结果显示,0.3g/L儿茶酚处理的蝴蝶兰叶片外植体离体培养3d,超氧阴离子水平明显低于对照(新鲜叶片为材料),过氧化氢含量略高于对照;0.1g/L柠檬酸处理的蝴蝶兰叶片外植体离体培养3d,超氧阴离子水平低于对照,过氧化氢含量与对照没有明显差异。根据百草枯促进外植体组织过氧化和叠氮钠抑制外植体组织过氧化,控制细胞内ROS水平,我们考察蝴蝶兰叶片外植体褐变发生情况。蝴蝶兰叶片离体培养3d,对照组、百草枯处理和叠氮钠处理的褐变率分别为96.3%、100%和86.67%;在离体培养的前3d内,POD的酶活分别在1.5d、ld和2d达到最大值,PPO的酶活的最大值出现在离体培养0d,0.5h后同落,对照组在1d达到次峰值,而后缓慢下降,百草枯处理组和叠氮钠处理组在1.5d达到次峰值,在3d再上升,前者酶活较后者低。表明褐变程度影响蝴蝶兰叶片外植体ROS含量,内源ROS水平与褐变开始时间呈正相关。组织褐变最终引起组织细胞死亡,本研究对褐变过程进行了更细致深入的探讨;光镜下,可见蝴蝶兰叶片只有海绵组织,有“8”字型的大维管束和“0”字型的小维管束,胞内叶绿体大而丰富,有部分紫红色的色素细胞分布在表皮,新鲜切下的叶薄片可见细胞间隙偶尔出现黑色积聚物,经改良苯酚品红或DAPI染色,可见细胞核结构紧密,核内可见数颗深色物。观察离体培养3d和6d的叶片外植体,细胞间隙和维管束内的黑色积聚物逐渐增多,叶绿体先是颜色褪去,继而解体成碎片,细胞核变大,但染色变浅,核内深色物变多变小,6d时观察到核形状不规则,甚至核膜破裂,核内物质外溢。再观察离体培养更长时间的叶片外植体,发现外植体的切口处积聚大量絮状深褐色物质,往内观察,可见细胞发生严重的质壁分离,膜内充满褐色物质,再往内,部分细胞只剩下黑褐色的细胞壁,外植体中央部分细胞黑褐色的细胞壁内有大量解体的叶绿体。提取褐变组织总DNA电泳,发现DNA有明显的弥散状降解。初步推测,褐变组织的死亡原因为坏死。