【摘 要】
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目的双歧杆菌是专性厌氧的人体益生菌,可选择性地在实体肿瘤的乏氧组织中滞留并增殖,是肿瘤基因-放射治疗中较理想的治疗基因递送载体.但目前双歧杆菌的转化是一个技术难
【机 构】
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北京大学基础医学院放射医学教研室,北京100191
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目的双歧杆菌是专性厌氧的人体益生菌,可选择性地在实体肿瘤的乏氧组织中滞留并增殖,是肿瘤基因-放射治疗中较理想的治疗基因递送载体.但目前双歧杆菌的转化是一个技术难题,与大肠杆菌等宿主菌的高转化效率不同,采用普通的原核质粒无法转化双歧杆菌.为此,本文提出双歧杆菌转化对质粒复制子具有"种属特异性"要求,并通过构建含有双歧杆菌特异复制子的新型大肠杆菌-双歧杆菌穿梭质粒,解决这一难题,为深入开展以双歧杆菌为基因递送栽体的肿瘤基因-放射治疗研究奠定基础.方法首先从GenBank获取长双歧杆菌隐性质粒pMB1的序列信息,采用Overlap-PCR方法获得其全长DNA,作为拟构建质粒的复制子；继而采用重组技术,将其与大肠杆菌质粒pMK4片段(含复制子pUC和抗氯霉素基因Cat)重组,构建大肠杆菌-双歧杆菌穿梭质粒；用电穿孔法将重组质粒转化双歧杆菌,通过观察不同电转参数下的转化效率,选择双歧杆菌转化的最佳条件.结果成功获得全长1 899 bp的pMB1复制子并构建成功含有pMB1和pUC双复制子的原核重组质粒,经酶切和测序鉴定正确,命名为pCMB1.以重组质粒成功转化了长双歧杆菌NCC2705和NQ 1501,而其它三种野生型双歧杆菌(包括一株长双歧杆菌)未能转化成功.使用pCMB1质粒转化长双歧杆菌NCC2705,在电场强度8.5 ～ 12.5kV/cm范围内,其转化效率的对数值与电场强度呈近似正相关；在质粒用量0.1 ～0.6 μ.g范围内,转化效率的对数值与质粒用量呈正相关,质粒用量＞0.6 μg时,转化效率反而下降；转化效率的对数值与转化时所用质粒的大小呈近似负相关.结论质粒中含有双歧杆菌种属特异的复制子是实现双歧杆菌转化的必要条件；即使是含有特异复制子的质粒在转化双歧杆菌时也具有种型甚至种株的局限性；选择最佳电转化条件能显著提高转化效率.
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