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目的:进一步了解伊马替尼对慢性粒细胞性白血病 (chronic myelogenous leukemial CML)患者体内BCR／ ABL融合基因阳性的原始及定向白血病干／祖细胞分化及增殖的影响,从而更深入阐明部分CML患者在经历一段血液学甚至是细胞遗传学水平上的完全缓解后复发及对伊马替尼耐药的机制。方法:1．CML患者骨髓源肿瘤干细胞的分离和培养:取耐伊马替尼、处于慢粒、慢性期、加速期或急变期的患者骨髓,用CD45、GlyA及CD34免疫磁珠阴性选择经 Ficoll-Paque分离液梯度分离得到的骨髓源单个核细胞后, 将阴性选择所得细胞接种在96孔细胞培养板中(每孔1个细胞),96孔板预先以ECM胶(含5 ng／mL BMP-4,30 ng／ mL SCF,10 ng／mL LIF及3％FCS)铺板,20天后,挑取单克隆细胞,扩增备用;2．FISH法检测Bcr／Abl融合基因的表达情况;3．体外定向诱导分化:取4×106个上述单细胞来源的扩增细胞,随机平均分成2份(2×106／份),分别向向血管内皮细胞、造血细胞定向诱导分化;4．体内移植:检测输注细胞在受体雌性NOD／SCID小鼠的分化分布及致瘤性, 二次移植:将已经证实骨髓中含有人源造血细胞的受体小鼠的骨髓细胞经尾静脉输入经过照射的NOD／SCID小鼠体内 (2107／只),2个月后,处死二次移植的受体小鼠,用上述的同样方法检测白血病细胞的分布与分化。5．耐药性检测:采用流式细胞术将BCR／ABL+Flk1+CD34-细胞分为三个亚群,即G0期、G1期及S／G2+M细胞,分别评估伊马替尼对三个亚群细胞的体外增殖及凋亡的影响。结果:1．通过极限稀释法获得的单克隆细胞在传代过程中始终保持CD 34、 CD45,CD31、vWF、GlyA、CD11a、CD11b阴性,而Flk1+ 细胞比例则达99％以上,故定义其为Flk1+CD34-细胞, 2． CML患者骨髓源、Bcr／Abl+、Flk1+CD34-细胞体内外均可向血管内皮细胞分化,参与机体内受损微血管的修复,能够分化为具有典型CML免疫表型的造血细胞,在受体NOD／ SCID小鼠体内成功重建类似人类所患的CML疾病模型;3．二次移植的实验结果同第一次移植结果;4．伊马替尼抑制处于G1期及S／G2+M的BCR／ABL+Flk1+CD34-细胞增殖及促进其凋亡的能力显著强于其对处于G 0期B C R／ ABL+Flk1+CD34-细胞的作用。5．一旦处于G0期BCR／ ABL+Flk1+CD34-细胞在造血刺激因子作用下开始进入细胞分裂周期,其对伊马替尼的敏感性随之恢复。结论: 1．处于 CML患者骨髓细胞中免疫表型为Flk1+CD34-、融合基因 Bcr／Abl阳性、具有血液血管干细胞特性的细胞是CML白血病干细胞;CML患者体内处于处于G0期的原始白血病干细胞对伊马替尼具有一定的抗性,临床上所观察到的CML患者在运用伊马替尼一段时间后出现正常的造血恢复现象,可能仅仅是因为伊马替尼杀死或抑制了定向恶性白血病祖细胞的增殖,但随着时间的推移,在经历了短暂的血液学甚至是细胞遗传学水平上的缓解后,对伊马替尼耐药、处于静止期的原始白血病干细胞终究会再次导致CML的复发。