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目的 HCMV在免疫低下人群中可引起严重疾病,其UL/b(UL133-UL151)区域为HCMV临床病毒株的独有区域,推测该区域与HCMV的临床致病性高度相关,本课题应用EGS技术应用沉默该区域UL148基因的表达,探讨EGS在人类细胞内对人巨细胞病毒临床病毒株UL148基因表达的抑制作用,为进一步探讨该基因的功能及寻求抗HCMV治疗提供理论依据.方法 根据UL148基因序列特点,针对UL148第762位点,设计并合成DNA性质EGS762.应用PCR技术扩增UL148基因,并将其克隆至pEGFP-N1载体,构建UL148真核表达载体,将其转染Hela细胞,经抗药性筛选后,获得稳定表达UL148基因的细胞株.将EGS762转染该细胞株后,沉默UL148基因的表达,以荧光显微镜及荧光定量PCR分析对该基因的沉默效果.同时设计不与UL148互补的C-EGS762及-1、+1、+2位点突变(位于切割位点两侧)的Mut-EGS762,分析其对UL148基因表达的影响,以鉴定EGS作为外源性物质本身对特异性基因表达的影响,以及以上3个位点对切割效率的影响.结果 将UL148基因克隆至pEGFP-N1质粒后,构建重组质粒pEGFP148,经PCR、双酶切及测序鉴定,pEGFP148构建成功.将其转染HeLa后,荧光显微镜下可观察到绿色荧光,经G418筛选后,成功构建稳定表达UL148基因的HeLa细胞株UL148-HeLa.将标记FAM基团的EGS762转染HeLa细胞,经流式细胞仪检测,其转染效率达90％以上.EGS在细胞中引导RNase P共同作用的靶基因UL148 RNA,经荧光定量PCR分析,UL148基因表达率降至25％左右.C-EGS762作用下UL148的表达率达97％以上,不影响其表达(P＞0.05),关键位点突变后的Mut-EGS762作用下,UL148基因表达率为69％,其表达率明显下降. 结论 1.DNA性质EGS可高效转染真核细胞；2.EGS762在真核细胞内特异性抑制UL148基因的表达；3.EGS作为外源性DNA物质无明显细胞毒性；4.EGS是一种理想的基因沉默工具,可进一步应用于UL148基因功能的研究,具有发展成为新型抗HCMV的小分子核酸药物.