论文部分内容阅读
目的：研制一种相容性好、有强度、可降解、能修复大面积关节软骨缺损的天然双层组织工程化软骨支架(ECM+BMG+C)。
方法：
(1)工程化软骨支架的制做：软骨细胞外基质(ECM)，加脱细胞、脱钙骨基质明胶(BMG)，冷冻真空干燥、交联后形成双层海棉状软骨支架(ECM+BMG)。
(2)种子细胞选择：自体骨髓间充质干细胞(BMSC)加软骨培养剂诱导培养，能在体外大量扩增。
(3)工程化软骨支架(ECM+BMG+C)的构建与移植：将(ECM+BMG)复合种子细胞(BMSC)在体外培养3天，倒置显微镜下检测细胞和支架的兼容性及生长状况良好，无细菌和支原体污染，方可移植到关节软骨缺损直径(4mm)处。
(4)多种捡测方法：A．光镜(UEM)、扫描电镜(SEM)下观察软骨支架(ECM+BMG)构建后的大体形态、孔径大小和孔隙率。B．采用生物力学方法测定工程化软骨组织块的强度。C．组织化学染色法：ECM、种子细胞可用涂片法、工程化软骨支架、用冰冻或石蜡切片，均可用Hoechst 33258和Gimesa、染色镜下观察ECM和软骨支架BMG中细胞脱凈后方可制成(ECM+BMG)支架。甲苯胺兰(TO)、奥新兰(AB)、藩红花"0"和11型胶原抗体免疫组化染色，可观察软骨基质、11型胶原的存在和特性。D．对构建好的组织工程化软骨块在倒置显微镜下观察：软骨支架(ECM+BMG)复合种子细胞后(ECM+BMG+C)有无毒性，(BMSC)细胞是否贴块生长，可用PI+AO荧光染色法观察细胞在支架中的活性。E．实验室检测：按照试剂盒说明测定软骨基质中GAG的含量。F.将工程化软骨组织块植入兔关节软骨缺损中，观察其在体内修复软骨缺损的组织形态特性.
结果：工程化软骨支架(ECM+BMG+C)：(1)倒置显微镜下见活细胞紧密贴附到支架材料上，生长良好。(2)用七种染色法：ECM用涂片法、BMG支架用冰冻切片,均用Hoechst 33258和Gimesa染色，见细胞95o/o已脱去。 (3)取工程化软骨组织块做P1+AO荧光染色，90 o/o为绿色活细胞。(4)甲苯胺兰染色呈紫兰色。AB染色为兰色。藩红花"O"染色为玫瑰红色。免疫组化11型胶原染色为宗黄色。(5)扫描电镜下见材料孔隙在150-300um之间，细胞和支架兼容性好。(6)植入兔体内的工程软骨组织块经6个月观察，十个关节有7个大体关节表面平整，镜下见关节软骨缺损修复，为类软骨组织结构。3个关节表面欠平整，为纤维软骨结构。
结论：双层软骨基质载体呈多孔海绵状、有强度、无毒性、复合种子细胞后兼容性好、有类软骨组织细胞的特性和修复大面积软骨缺损的可能。具有较好的应用前景。