多拷贝整合表达载体的构建实现黑曲霉木聚糖酶在酿酒酵母中的高效表达

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内切-β-1,4-木聚糖酶(endo-β-1,4-xylanase A;EC 3.2.1)能降解木聚糖形成木糖或各类低聚木糖,故广泛用于饲料、食品、造纸、纺织和酿造工业,是一种重要的工业用酶。低聚木糖是倍受瞩目的一种低聚糖,它不仅可以使双歧杆菌增殖,选择利用性高,而且附加值和售价也比较高,具有良好的市场价值。木聚糖是植物细胞壁中的主要组分,是自然界重要的可再生资源之一,我国又盛产玉米,有丰富的玉米芯和玉米秸杆,玉米芯、玉米秸秆中富含半纤维素,半纤维素的主要成分就是木聚糖,而在酿造工业中酿酒酵母却不能直接利用木聚糖作为碳源,故通过筛选酶活较高的黑曲霉木聚糖酶,利用分子生物学手段使其整合到酿酒酵母的基因组中,并获得组成型高效表达。从一株高产木聚糖酶的黑曲霉菌株中克隆到稳定性较高的酸性木聚糖酶,用TRIZOL法提取该菌的总RNA,通过反转录获得完整的cDNA序列,在酿酒酵母穿梭质粒pUG6上连入通过重叠延伸PCR的方法获得的酵母磷酸甘油激酶(phosphoglycerate kinase,PGK)组成型强启动子,黑曲霉(Aspergillus niger)内切-β-1,4-木聚糖酶(endo-β-1,4-xylanase A,xynA)基因和细胞色素C1(Cytochromel,CYC1)终止子序列三个片段的融合片段,即PGK-xynA-CYC1,另外为了获得多拷贝,还在载体中引入特定的2.2kbrDNA片段构建成重组表达质粒pURPX,并将其引入酿酒酵母菌株YS2中,实现木聚糖酶在酿酒酵母中的高效表达。
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