论文部分内容阅读
目的：研究端粒酶启动子调控nm23-H1基因逆转人肺腺癌转移机制。方法：通过浓度梯度法测定A549/nm23-H1-shRNA细胞的潮霉素最佳筛选浓度;分别利用双酶切的和PCR的技术手段，获取重组表达载体DNA的大小片段，然后经过连接酶进行DNA大小片段的连接，最终得到我们所需要的重组表达质粒;应用real time PCR及Western blot检测nm23-H1基因在A549/nm23-H1-shRNA-luc细胞中的表达情况;将A549/nm23-H1-shRNA-luc细胞株接种于裸鼠右后腹股沟皮下后，应用活体成像技术检测shRNA抵抗的nm23-H1 cDNA对A549/nm23-H1-shRNA-luc细胞在裸鼠体内成瘤性和转移能力的影响。结果:L.A549/nm23-H1-shRNA细胞株的潮霉素最佳筛选浓度为300μg/ml;通过限制性内切酶NheI和XbaI对PGL3-htp26O-Enhancer质粒进行双酶切，成功获得构建重组表达载体的DNA大片段;Real time PCR及western blot实验结果显示，对shRNA抵抗的nm23-H1 cDNA能够通过转染试剂转入A549/nm23-H1-shRNA-luc细胞中，并能正常表达nm23-H1 mRNA及nm23-H1蛋白。活体内成像结果表明，shRNA抵抗的nm23-H1 cDNA能抑制A549/nm23-H1-shRNA-luc细胞在裸鼠体内的成瘤性和转移能力。结论:成功构建转基因肺癌细胞株A549/nm23-H1-shRNA-luco;成功构建重组表达载体PGL3-htpzso-nm23-H1 cDNA(shRNA-resistant nm23-H1 cDNA);shRNA抵抗的nm23-H1 cDNA能在A549/nm23-H1-shRNA-luc细胞株中正常表达nm23-H1 mRNA和nm23-H1蛋白;转染shRNA抵抗的nm23-H1 cDNA能在体内外抑制A549/nm23-H1-shRNA-luc细胞的增殖和侵袭转移能力。