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目的：观察转染鞘氨醇激酶1(sphingosine kinase-1,SPHK1)活性的脐带间充质干细胞(mesenchymal stem cells derived from human umbilical cord,UCMSC)和UCMSC对多发性硬化的实验动物模型：实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE)小鼠治疗效果的研究,并探讨其可能的机制.
方法：采用组织块法分离培养UCMSC,运用流式细胞仪检测多种分子表面标志,以确定分离培养出来的细胞符合UCMSC细胞免疫表型,同时对UCMSC进行相关质控工作.携带SPHK1基因的腺病毒载体,滴度为1.2531011/ml.第三代UCMSC复苏在细胞培养皿中,培养基为含10％胎牛血清的DMEM培养基(dulbecco"sminimum essential medium,DMEM).当细胞长满细胞培养皿3/4时,更换血清浓度为5％的DMEM培养基,按照腺病毒滴度,每个细胞培养皿加入16ul携带有SPHK1基因的腺病毒.腺病毒刺激UCMSC48小时后收集UCMSC,然后提取蛋白.之后用westernblot实验方法检测UCMSC中SPHK1的表达,并和未转染病毒的UCMSC、转染未携带SPHK1基因病毒的UCMSC比较.采用髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG35-55)作为抗原与完全弗氏佐剂免疫C57BL/6小鼠制作EAE模型,UCMSC-SPHK1组小鼠分别在免疫后第7、14、21、28d通过尾静脉注射转染SPHK1活性的UCMSC(5.53106/只,0.2ml),UCMSC组小鼠尾静脉注射UCMSC(5.53106/只,0.2ml),对照组和EAE组注射同等体积的生理盐水.采用临床评分和脊髓病理切片评估各组小鼠发病情况.免疫组化方法检测各组小鼠脊髓星形胶质细胞酸性蛋白(GFAP)、髓鞘碱性蛋白(MBP)的表达.流式细胞术检测小鼠脾脏淋巴细胞NK细胞、调节性T细胞CD4+CD25+的表达变化.ELISA检测小鼠外周血细胞因子干扰素γ(IFN-γ)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白介素17(IL-17)和白介素4(IL-4)的含量.
结果：采用组织块法可方便经济的从脐带中成功分离出间充质干细胞,流式细胞仪检测细胞表达间充质干细胞分子表面标志的CD44,CD29和CD105,并不表达人白细胞抗原-DR、内皮细胞标志的CD31和造血细胞表面抗原的CD45;分离培养的UCMSC没有细菌、真菌、乙肝病毒、HIV病毒和内毒素的污染,可用于接下来的实验.经westernblot分析,转染SPHK1基因的UCMSC明显高表达SPHK1蛋白,而未转染病毒的UCMSC、转染未携带SPHK1基因病毒的UCMSC,SPHK1蛋白表达量明显较低.髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG35-55)与完全弗氏佐剂免疫C57BL/6小鼠成功制作EAE模型,14天左右小鼠陆续出现神经功能缺失症状.经尾静脉注射干细胞治疗后,UCMSC-SPHK1组小鼠症状明显较UCMSC组小鼠和EAE组小鼠轻,临床评分明显减低.UCMSC-SPHK1组小鼠脊髓HE染色,炎性细胞较UCMSC组小鼠和EAE组小鼠明显减少,脊髓Fast-blue染色显示,髓鞘脱失较另外两组明显减少.各组小鼠脊髓免疫组化对比表明,在GFAP的表达上,UCMSC-SPHK1组小鼠明显少于UCMSC组和EAE组.在MBP表达上,UCMSC-SPHK1组小鼠髓鞘脱失较少,MBP表达量明显多于UCMSC组和EAE组.流式细胞术检测显示,UCMSC-SPHK1组小鼠脾脏淋巴细胞中,NK细胞较UCMSC组和EAE组明显减少,而调节性T细胞CD4+CD25+的表达较上述两组明显增多.外周血ELISA检测显示,UCMSC-SPHK1组小鼠外周血中细胞因子IFN-γ、TNF-α和IL-17表达量较UCMSC组和EAE组减少,而IL-4的表达量较上述两组升高.所有的实验数据都使用SPSS10.0统计软件统计分析,两组间比较采用T检验的方法,多个样本均数之间比较采用单因素方差分析的方法.
结论：转染SPHK1基因的UCMSC明显高表达SPHK1蛋白,具有SPK活性;MOG35-55与完全弗氏佐剂免疫C57BL/6小鼠成功制作EAE模型;经尾静脉注射转染SPHK1基因的UCMSC后,小鼠症状明显减轻,脊髓炎性细胞明显减少,髓鞘脱失也明显减少,脊髓GFAP表达减少,MBP损失较少.经尾静脉注射转染SPHK1基因的UCMSC后,小鼠脾脏中杀伤性细胞减少,而调节性T细胞增多;外周血ELISA表明,Th1型细胞因子减少,Th2型细胞因子增多.经尾静脉注射转染SPHK1基因的UCMSC后,小鼠免疫调节功能明显增强,因此,结果提示具有SPK活性的UCMSC可能成为治疗MS的一种新型生物方法.