论文部分内容阅读
目的:研究GNAO1在儿童白血病肿瘤细胞中的转录方式.
方法:在16例ALL患儿的白血病细胞全外显子测序中发现存在GNAO1基因的复发突变,但在实验过程中不能克隆出已报道的转录本,考虑儿童白血病肿瘤细胞中可能存在GNAO1的新的转录变异体.GNAO1已报道编码蛋白的转录本有6种,针对每一种转录本设计带酶切位点的克隆引物并进行PCR,并依据各转录本在基因组DNA上的起始终止顺序将引物交叉配对进行PCR.针对GNA01-001和GNA01-002转录本共有的4号和5号外显子区域内设计基因特异性的RACE引物(GSP),使用SMARTer RACE cDNA扩增试剂盒针对TEL-AML1阳性患儿的RNA进行反转录和PCR,最终通过测序获得了GNA01转录本的完整序列。
结果:GNAO1-001和GNAO1-002转录本为已报道的完整转录本并表达有功能的蛋白,使用特异性克隆引物针对儿童白血病细胞cDNA进行克隆反应PCR,无法扩增出正确条带。GNAO1的005,008和011转录本未报道3端序列,007转录本未报道5端序列,针对以上4种转录本的一直序列设计了特异性克隆引物并进行PCR与组合PCR,也无法扩增出正确条带,推测GNA01可能存在一种全新的未报道过的转录本。在针对GNAO1-002转录本设计各外显子引物并且使用儿童白血病细胞DNA进行PCR时,可以得到4号外显子到8号外显子的正确序列,故在4号和5号外显子区域内设计了特异性的RACE引物。使用SMARTer RACE cDNA扩增试剂盒,按照相应的实验步骤获得到第一链反应产物。通过相应的PCR反应扩增后获得了特异性条带,将PCR产物切胶回收并用质粒克隆转化后,提取质粒基因组序列送测序,获得了GNAO1转录本的完整序列,在5端可见完整UPM序列,3端可见完整UPM序列及PolyA序列。新的GNAO1转录本共有7个外显子,1和2号外显子均为新的外显子,其中1号外显子位于002转录本的2号外显子和3号外显子之间,2号外显子位于002转录本的3号外显子和4号外显子之间,3~7号外显子分别对应002转录本的4~8号外显子,与之前的实验结果相符合。
结论:在儿童白血病细胞中发现了GNAO1未报道过的新的转录方式,该转录本在儿童白血病发病中的作用有待进一步研究。