【摘 要】
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目的 分析甲型H5N1流感病毒（简称H5N1）神经氨酸酶（neuraminidase, NA）生物信息学特征，原核表达获得H5N1 NA重组蛋白，并在动物模型中评价其免疫原性。方法 利用生物信息学软件分析H5N1 NA的理化性质、跨膜区、信号肽以及二级结构和高级结构。将H5N1 NA的编码区进行密码子优化后基因合成，将合成目的基因片段与pET-22b（+）连接，构建重组原核表达质粒pET-22b（
【机 构】
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武汉生物制品研究所有限责任公司病毒性疫苗研究二室国家联合疫苗工程技术研究中心
【基金项目】
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国家“重大新药创制”科技重大专项资助项目（2016ZX09106003-008）；
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目的 分析甲型H5N1流感病毒（简称H5N1）神经氨酸酶（neuraminidase, NA）生物信息学特征，原核表达获得H5N1 NA重组蛋白，并在动物模型中评价其免疫原性。方法 利用生物信息学软件分析H5N1 NA的理化性质、跨膜区、信号肽以及二级结构和高级结构。将H5N1 NA的编码区进行密码子优化后基因合成，将合成目的基因片段与pET-22b（+）连接，构建重组原核表达质粒pET-22b（+）-H5N1 NA,将重组质粒转化到BL21（DE3）感受态细胞并进行诱导表达；超声破碎菌体，使用Ni-NTA亲和层析纯化，梯度透析复性，SDS-PAGE分析纯度，Bradford法测定浓度；分别用5、10和50μg的NA加或不加MF59佐剂免疫BALB/c小鼠，检测其诱导产生NA特异性抗体滴度，评价免疫原性。结果 经一系列生物信息学软件分析得知，H5N1 NA为稳定的亲水性跨膜蛋白，无信号肽，二级结构以无规则卷曲和α螺旋为主，高级结构为四聚体结构，相对分子质量48 941.92,分子式C2148H3293N595O666S26,等电点6.13,不稳定系数31.84,总平均亲水性-0.268;经双酶切和测序验证，重组质粒pET-22b（+）-H5N1 NA构建成功，转化至E.coli BL21（DE3）,经诱导表达、纯化、复性、浓缩获得重组NA纯度为94%,相对质量浓度为620.23μg/mL,具有酶活性；使用该原核表达的NA免疫BALB/c小鼠，能产生结合H5N1疫苗原液中NA的特异性抗体，50μg+MF59佐剂组平均效价达3 520。结论 原核表达的NA免疫小鼠诱导产生的抗体能够与甲型H5N1流感病毒天然的NA发生反应，为基于NA的流感重组亚单位疫苗研发提供了可行路径。
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