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[关键词]萝卜硫素;人皮肤鳞状细胞癌;凋亡;增殖;lncRNA MALAT1/TFEB信号通路;机制
皮肤鳞状细胞癌（Skin squamous cell carcinoma，SSCC）是最常见的皮肤癌，仅次于基底细胞癌，占全球已知皮肤癌的20%～50%[1]。手术治疗只对早期或已确诊的SSCC患者有效，而对伴发其他疾病和使用免疫抑制剂或抗凝剂的老年患者不适合手术治疗，还会对患者外貌带来不良影响[2-3]。因此，寻找高效、低副作用的新型抗肿瘤药物迫在眉睫。萝卜硫素抗肿瘤活性的研究更加受到重视，并且其还具有防治皮肤癌和光防护作用，主要包括预防皮肤炎症、红斑、皮肤上皮细胞氧化应激损伤、光老化及皮肤肿瘤等[4]，其中对黑素瘤细胞增殖具有明显的抑制作用[5]。然而，关于萝卜硫素对人皮肤鳞状细胞癌细胞增殖的药理抑制作用研究甚少，于是本文探讨了萝卜硫素对A431细胞增殖和凋亡的影响。
1 材料和方法
1.1 主要材料：人皮膚鳞状细胞癌A431细胞株（上海ATCC细胞库）;DMEM培养液、胎牛血清、胰蛋白酶（Gibco公司）;CCK-8试剂盒（Solarbio公司）;RIPA裂解液（杭州四季青公司）;BCA蛋白定量试剂盒（北京康为世纪）;Annexin V/FITC细胞凋亡试剂盒（北京四正柏生物公司）;Caspase-3/9活性检测试剂盒（Solarbio公司）;兔抗鼠t-PARP、cle-PARP、cle-Caspase-3、TFEB、TFEB（Ser142）及β-actin抗体（美国CST公司）;羊抗兔IgG二抗（上海谷歌生物公司）;ELC化学发光检测试剂盒（Advansta）。
1.2 主要仪器：BIORAD-550型酶标仪（美国伯乐公司）;BBS-V800型单人超净台（山东鑫贝西公司）;SPX-250型细胞培养箱（美国Thermo公司）;GE-100型凝胶电泳仪（北京六一仪器厂）;Amersham Imager 600仪器（BIORAD，美国）;FACSCalibur型流式细胞仪（美国BectonDickinson公司）。
1.3 A431细胞培养：采用含10%胎牛血清和1%抗生素的的DMEM培养基对A431细胞进行培养，培养箱条件设置为5%CO2、37℃恒温。待细胞融合至90%左右时，便进行传代培养。首先PBS清洗细胞2遍，加入胰蛋白酶进行消化细胞，待细胞变圆后加入培养基终止消化，转移至Ep离心管，1 000rpm离心5min，弃去旧培养液，加入新鲜培养液重悬细胞进行后续实验。
1.4 CCK-8实验：将对数期A431细胞接种于96孔板，每孔1×104个细胞，培养过夜，然后加入5～40μg/ml的萝卜硫素处理细胞24、48、72、96h后，弃去旧培养液，每孔加入100μl含10μl的CCK-8试剂的DMEM培养液，放入培养箱中继续孵育1.5h，在酶标仪450nm波长处检测细胞吸光度OD值，并计算细胞相对活力。计算公式如下：细胞相对活力（%）=OD实验组/OD对照组×100%。
1.5 细胞克隆数分析：将对数期A431细胞接种于6孔板，每孔1 000个细胞，培养过夜，然后加入5～40μg/ml的萝卜硫素处理细胞6d后，每2d更换一次含药的新鲜培养液;然后对克隆细胞进行染色并计数。
1.6 BrdU ELISA实验：将对数期A431细胞接种于96孔板，每孔1×104个细胞，培养过夜;5～40μg/ml的萝卜硫素处理细胞48h后，加入BrdU试剂孵育12h;再采用ELISA试剂盒检测BrdU偶联的细胞，并在酶标仪450nm处测定其吸光度OD值。
1.7 流式细胞术：收集各组细胞，PBS清洗2次，采用2.0mg/ml的PI染液和RNase I染色30min，流式细胞仪立即检测细胞周期分布情况。另外，收集细胞，PBS重悬后，分别加入Annexin-V FITC和PI处理细胞（按照试剂盒操作说明书进行），最后用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。
1.8 RT-PCR实验： 收集各组细胞， PBS清洗2次， 用T R I z o l 试剂提取总R N A ， 采用1 m g 的R N A 、随机引物和AffinityScript QPCR cDNA合成试剂逆转录合成cDNA。再利用iQ5实时PCR仪扩增lncRNA MALAT1基因产物，引物序列如下：正向5‘-AGGCGTTGTG-CGTAGAGGA-3’，反向5‘-GGATTTTTACCAA-CCACTCGC-3’。
1.9 Western blot实验：收集各组细胞，每组加入200μl的裂解液，置于冰上充分裂解30min，收集细胞裂解液，4℃条件下离心12 000rpm，收集上清。BCA法检测了上清中总蛋白浓度，每孔上样40μg进行电泳分离，恒压70V，电泳3h。然后在恒流275mA条件下电转70min，5%脱脂牛奶封闭1h后，将目的条带放入对应的一抗溶液（稀释比1 ： 1 000）中，4℃摇床孵育过夜。TBST洗膜3次，每次10min，再把条带放入盛二抗（稀释比1：3 000）的平皿中室温孵育1h，TBST洗膜3次，每次10min。加入4ml的ECL显影液显色3min，凝胶成像系统曝光。
1.10 Caspase活性试验：收集各组细胞，采用Caspaseglot-3/-9活性测定试剂盒检测Caspase-3/9活性，酶标仪在405nm处测定其吸光度值。
1.11 lncRNA MALAT1质粒转染：ANXA3 mimics质粒由武汉巴菲尔生物有限公司合成，采用Lipofectamine 2 000试剂转染质粒至A431细胞，具体操作步骤严格按照说明书进行。
1.12 统计学分析：采用SPSS 19.0统计软件进行统计分析，两两组间比较采用t 检验，多组间比较采用单因素方差分析，P <0.05为差异具有统计学意义。 2 结果
2.1 萝卜硫素降低A431细胞增殖活性：不同浓度萝卜硫素处理A431细胞72、96h后，剂量大于10μg/ml的萝卜硫素能明显降低细胞活力（P<0.05，见图1A）。当萝卜硫素浓度大于10μg/ml时，能明显降低A431细胞的克隆数（P <0.05，见图1B）。对BrdU偶联细胞数检测发现，萝卜硫素可显著降低BrdU偶联细胞数（P <0.05，图1C）。流式细胞术对A431细胞周期检测发现，萝卜硫素处理组G1期细胞数明显增多，而S和G2期细胞数明显减少（P <0.05，图1D）;提示萝卜硫素可将A431细胞阻滞在G1期，降低其增殖活性。
2.2 萝卜硫素诱导A431细胞凋亡：实验进一步观察萝卜硫素对A431细胞凋亡的影响，发现萝卜硫素可下调抗凋亡蛋白t-PARP表达，上调促凋亡蛋白cle-PARP和cle-Caspase-3表达（见图2A）。另外，浓度大于10μg/ml的萝卜硫素还能明显诱导促凋亡蛋白Caspase-3和Caspase-9活性，与0μg/ml的萝卜硫素组相比差异有统计学意义（P <0.05，见图2B）。对A431细胞中组蛋白DNA检测发现，萝卜硫素能显著增高细胞中组蛋白DNA水平（P <0.05，见图2C）。流式细胞术检测A431细胞凋亡率发现，萝卜硫素可显著诱导细胞凋亡（P <0.05，见图2D）。
2.3 萝卜硫素下调lncRNA MALAT1表达水平：实验进一步观察萝卜硫素诱导A431细胞凋亡的分子机制，检测了MALAT1mRNA的表达水平。结果如图3所示，发现5μg/ml的萝卜硫素可降低MALAT1 mRNA表达，但与0μg/ml萝卜硫素组比较差异没有统计学意义（P >0.05）。然而，当萝卜硫素浓度大于10μg/ml时，A431细胞中MALAT1 mRNA表达水平明显降低（P <0.05）。
2.4 萝卜硫素上调TFEB表达水平：实验进一步考察萝卜硫素对lncRNA MALAT1下游转录因子TFEB表达水平的影响，结果见图4：萝卜硫素浓度大于5μg/ml时，TFEB表达水平相比于0μg/ml萝卜硫素组明显增高（P <0.05），而TFEB（Ser142）磷酸化水平则显著降低（P <0.05）。
2.5 萝卜硫素通过lncRNA MALAT1降低A431细胞活力：实验进一步观察萝卜硫素是否通过lncRNA MALAT1信号通路抑制A431细胞增殖，将lncRNA MALAT1基因在A431细胞中过表达（见图5A）。另外，发现SFP+MALAT1组细胞中TFEB（Ser142）磷酸化水平和细胞相对活力相比于SFP组明显增高（P <0.05，见图5B～D）。
3 讨论
转录因子EB（TFED）是溶酶体生物发生的主要调节因子，通过正向调节溶酶体表达和信号网络基因来参与细胞生物学行为[6-7]。肺癌转移相关转录本1（MALAT1）是长链非编码RNA（lncRNA）的成员，表达于多种肿瘤细胞[8]。早期已有研究报道，MALAT1在皮肤癌的发生发展中起着重要的作用。MALAT1的沉默会延缓黑素瘤的生长[9-10]，MALAT1高表达对SSCC的发生发展起促进作用[11]。
萝卜硫素能抑制肿瘤细胞生长，并表现出一定的生物学效应，但这些作用机制仍未阐明。本研究旨在进一步揭示萝卜硫素在体外培养的A431细胞中发挥抗增殖作用的机制。证实萝卜硫素诱导A431細胞凋亡;抑制TFEB（Ser142）磷酸化，激活TFEB表达，从而促使凋亡相关基因的表达;萝卜硫素通过调节lncRNA MALAT1表达降低A431细胞增殖活性。癌症治疗的研究已经确定细胞凋亡是化疗或放疗的结果，细胞凋亡是由基因调控的细胞自主程序性死亡，多种基因的活化状态介导该过程。凋亡途径包含死亡受体途径及线粒体途径，均能引发效应性Caspase-3活化，进而导致内切核酸酶活化，诱导细胞凋亡发生[12-13]。Caspase是调控细胞凋亡的主要蛋白，主要通过抑制Caspase-3和Caspase-9活性阻断细胞的凋亡，并且这些蛋白的表达水平与人皮肤鳞状细胞癌的增殖、凋亡相关密切[14-15]。本实验发现萝卜硫素可明显增强Caspase-3/9活性，增高促凋亡蛋白cle-PARP和cle-Caspase-3表达，进而诱导A431细胞凋亡。
实验还研究了萝卜硫素诱导A431细胞凋亡的潜在分子机制。转录因子MiTF/TFE家族TFEB是肿瘤细胞存活和能量代谢的调节因子[16]。TFEB在细胞死亡中的作用仍然存在争议，有研究提出激活TFEB可防止酒精引起的脂肪变性和肝损伤[17];然而，也有研究指出诱导TFEB转录因子核移位，可通过提高溶酶体膜通透性触发细胞凋亡[18]。也有研究表明，TFEB被激活转移到细胞核，并通介导骨肉瘤细胞的死亡[19]。与上述研究结果类似，本实验发现萝卜硫素降低TFEB（Ser142）磷酸化水平，诱导TFEB表达，说明萝卜硫素可促使TFEB向核转移，进而诱导A431细胞凋亡。
MALAT1表达于多种肿瘤细胞，在多种皮肤癌疾病的发生发展过程中起重要作用[6-9]。此外，MALAT1信号通路激活还可促使胆囊癌细胞的增殖和转移[20]。本实验提示萝卜硫素降低MALAT1表达，并且MALAT1过表达降低了萝卜硫素对TFEB（Ser142）磷酸化水平和细胞活力的抑制作用。由此说明，萝卜硫素可通过调节MALAT1/TFEB信号传导介导A431细胞凋亡。综上所述，萝卜硫素可通过诱导A431细胞凋亡和抑制细胞增殖发挥抗肿瘤作用，其机制可能与抑制lncRNAMALAT1/TFEB信号通路活化有关。
皮肤鳞状细胞癌（Skin squamous cell carcinoma，SSCC）是最常见的皮肤癌，仅次于基底细胞癌，占全球已知皮肤癌的20%～50%[1]。手术治疗只对早期或已确诊的SSCC患者有效，而对伴发其他疾病和使用免疫抑制剂或抗凝剂的老年患者不适合手术治疗，还会对患者外貌带来不良影响[2-3]。因此，寻找高效、低副作用的新型抗肿瘤药物迫在眉睫。萝卜硫素抗肿瘤活性的研究更加受到重视，并且其还具有防治皮肤癌和光防护作用，主要包括预防皮肤炎症、红斑、皮肤上皮细胞氧化应激损伤、光老化及皮肤肿瘤等[4]，其中对黑素瘤细胞增殖具有明显的抑制作用[5]。然而，关于萝卜硫素对人皮肤鳞状细胞癌细胞增殖的药理抑制作用研究甚少，于是本文探讨了萝卜硫素对A431细胞增殖和凋亡的影响。
1 材料和方法
1.1 主要材料：人皮膚鳞状细胞癌A431细胞株（上海ATCC细胞库）;DMEM培养液、胎牛血清、胰蛋白酶（Gibco公司）;CCK-8试剂盒（Solarbio公司）;RIPA裂解液（杭州四季青公司）;BCA蛋白定量试剂盒（北京康为世纪）;Annexin V/FITC细胞凋亡试剂盒（北京四正柏生物公司）;Caspase-3/9活性检测试剂盒（Solarbio公司）;兔抗鼠t-PARP、cle-PARP、cle-Caspase-3、TFEB、TFEB（Ser142）及β-actin抗体（美国CST公司）;羊抗兔IgG二抗（上海谷歌生物公司）;ELC化学发光检测试剂盒（Advansta）。
1.2 主要仪器：BIORAD-550型酶标仪（美国伯乐公司）;BBS-V800型单人超净台（山东鑫贝西公司）;SPX-250型细胞培养箱（美国Thermo公司）;GE-100型凝胶电泳仪（北京六一仪器厂）;Amersham Imager 600仪器（BIORAD，美国）;FACSCalibur型流式细胞仪（美国BectonDickinson公司）。
1.3 A431细胞培养：采用含10%胎牛血清和1%抗生素的的DMEM培养基对A431细胞进行培养，培养箱条件设置为5%CO2、37℃恒温。待细胞融合至90%左右时，便进行传代培养。首先PBS清洗细胞2遍，加入胰蛋白酶进行消化细胞，待细胞变圆后加入培养基终止消化，转移至Ep离心管，1 000rpm离心5min，弃去旧培养液，加入新鲜培养液重悬细胞进行后续实验。
1.4 CCK-8实验：将对数期A431细胞接种于96孔板，每孔1×104个细胞，培养过夜，然后加入5～40μg/ml的萝卜硫素处理细胞24、48、72、96h后，弃去旧培养液，每孔加入100μl含10μl的CCK-8试剂的DMEM培养液，放入培养箱中继续孵育1.5h，在酶标仪450nm波长处检测细胞吸光度OD值，并计算细胞相对活力。计算公式如下：细胞相对活力（%）=OD实验组/OD对照组×100%。
1.5 细胞克隆数分析：将对数期A431细胞接种于6孔板，每孔1 000个细胞，培养过夜，然后加入5～40μg/ml的萝卜硫素处理细胞6d后，每2d更换一次含药的新鲜培养液;然后对克隆细胞进行染色并计数。
1.6 BrdU ELISA实验：将对数期A431细胞接种于96孔板，每孔1×104个细胞，培养过夜;5～40μg/ml的萝卜硫素处理细胞48h后，加入BrdU试剂孵育12h;再采用ELISA试剂盒检测BrdU偶联的细胞，并在酶标仪450nm处测定其吸光度OD值。
1.7 流式细胞术：收集各组细胞，PBS清洗2次，采用2.0mg/ml的PI染液和RNase I染色30min，流式细胞仪立即检测细胞周期分布情况。另外，收集细胞，PBS重悬后，分别加入Annexin-V FITC和PI处理细胞（按照试剂盒操作说明书进行），最后用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。
1.8 RT-PCR实验： 收集各组细胞， PBS清洗2次， 用T R I z o l 试剂提取总R N A ， 采用1 m g 的R N A 、随机引物和AffinityScript QPCR cDNA合成试剂逆转录合成cDNA。再利用iQ5实时PCR仪扩增lncRNA MALAT1基因产物，引物序列如下：正向5‘-AGGCGTTGTG-CGTAGAGGA-3’，反向5‘-GGATTTTTACCAA-CCACTCGC-3’。
1.9 Western blot实验：收集各组细胞，每组加入200μl的裂解液，置于冰上充分裂解30min，收集细胞裂解液，4℃条件下离心12 000rpm，收集上清。BCA法检测了上清中总蛋白浓度，每孔上样40μg进行电泳分离，恒压70V，电泳3h。然后在恒流275mA条件下电转70min，5%脱脂牛奶封闭1h后，将目的条带放入对应的一抗溶液（稀释比1 ： 1 000）中，4℃摇床孵育过夜。TBST洗膜3次，每次10min，再把条带放入盛二抗（稀释比1：3 000）的平皿中室温孵育1h，TBST洗膜3次，每次10min。加入4ml的ECL显影液显色3min，凝胶成像系统曝光。
1.10 Caspase活性试验：收集各组细胞，采用Caspaseglot-3/-9活性测定试剂盒检测Caspase-3/9活性，酶标仪在405nm处测定其吸光度值。
1.11 lncRNA MALAT1质粒转染：ANXA3 mimics质粒由武汉巴菲尔生物有限公司合成，采用Lipofectamine 2 000试剂转染质粒至A431细胞，具体操作步骤严格按照说明书进行。
1.12 统计学分析：采用SPSS 19.0统计软件进行统计分析，两两组间比较采用t 检验，多组间比较采用单因素方差分析，P <0.05为差异具有统计学意义。 2 结果
2.1 萝卜硫素降低A431细胞增殖活性：不同浓度萝卜硫素处理A431细胞72、96h后，剂量大于10μg/ml的萝卜硫素能明显降低细胞活力（P<0.05，见图1A）。当萝卜硫素浓度大于10μg/ml时，能明显降低A431细胞的克隆数（P <0.05，见图1B）。对BrdU偶联细胞数检测发现，萝卜硫素可显著降低BrdU偶联细胞数（P <0.05，图1C）。流式细胞术对A431细胞周期检测发现，萝卜硫素处理组G1期细胞数明显增多，而S和G2期细胞数明显减少（P <0.05，图1D）;提示萝卜硫素可将A431细胞阻滞在G1期，降低其增殖活性。
2.2 萝卜硫素诱导A431细胞凋亡：实验进一步观察萝卜硫素对A431细胞凋亡的影响，发现萝卜硫素可下调抗凋亡蛋白t-PARP表达，上调促凋亡蛋白cle-PARP和cle-Caspase-3表达（见图2A）。另外，浓度大于10μg/ml的萝卜硫素还能明显诱导促凋亡蛋白Caspase-3和Caspase-9活性，与0μg/ml的萝卜硫素组相比差异有统计学意义（P <0.05，见图2B）。对A431细胞中组蛋白DNA检测发现，萝卜硫素能显著增高细胞中组蛋白DNA水平（P <0.05，见图2C）。流式细胞术检测A431细胞凋亡率发现，萝卜硫素可显著诱导细胞凋亡（P <0.05，见图2D）。
2.3 萝卜硫素下调lncRNA MALAT1表达水平：实验进一步观察萝卜硫素诱导A431细胞凋亡的分子机制，检测了MALAT1mRNA的表达水平。结果如图3所示，发现5μg/ml的萝卜硫素可降低MALAT1 mRNA表达，但与0μg/ml萝卜硫素组比较差异没有统计学意义（P >0.05）。然而，当萝卜硫素浓度大于10μg/ml时，A431细胞中MALAT1 mRNA表达水平明显降低（P <0.05）。
2.4 萝卜硫素上调TFEB表达水平：实验进一步考察萝卜硫素对lncRNA MALAT1下游转录因子TFEB表达水平的影响，结果见图4：萝卜硫素浓度大于5μg/ml时，TFEB表达水平相比于0μg/ml萝卜硫素组明显增高（P <0.05），而TFEB（Ser142）磷酸化水平则显著降低（P <0.05）。
2.5 萝卜硫素通过lncRNA MALAT1降低A431细胞活力：实验进一步观察萝卜硫素是否通过lncRNA MALAT1信号通路抑制A431细胞增殖，将lncRNA MALAT1基因在A431细胞中过表达（见图5A）。另外，发现SFP+MALAT1组细胞中TFEB（Ser142）磷酸化水平和细胞相对活力相比于SFP组明显增高（P <0.05，见图5B～D）。
3 讨论
转录因子EB（TFED）是溶酶体生物发生的主要调节因子，通过正向调节溶酶体表达和信号网络基因来参与细胞生物学行为[6-7]。肺癌转移相关转录本1（MALAT1）是长链非编码RNA（lncRNA）的成员，表达于多种肿瘤细胞[8]。早期已有研究报道，MALAT1在皮肤癌的发生发展中起着重要的作用。MALAT1的沉默会延缓黑素瘤的生长[9-10]，MALAT1高表达对SSCC的发生发展起促进作用[11]。
萝卜硫素能抑制肿瘤细胞生长，并表现出一定的生物学效应，但这些作用机制仍未阐明。本研究旨在进一步揭示萝卜硫素在体外培养的A431细胞中发挥抗增殖作用的机制。证实萝卜硫素诱导A431細胞凋亡;抑制TFEB（Ser142）磷酸化，激活TFEB表达，从而促使凋亡相关基因的表达;萝卜硫素通过调节lncRNA MALAT1表达降低A431细胞增殖活性。癌症治疗的研究已经确定细胞凋亡是化疗或放疗的结果，细胞凋亡是由基因调控的细胞自主程序性死亡，多种基因的活化状态介导该过程。凋亡途径包含死亡受体途径及线粒体途径，均能引发效应性Caspase-3活化，进而导致内切核酸酶活化，诱导细胞凋亡发生[12-13]。Caspase是调控细胞凋亡的主要蛋白，主要通过抑制Caspase-3和Caspase-9活性阻断细胞的凋亡，并且这些蛋白的表达水平与人皮肤鳞状细胞癌的增殖、凋亡相关密切[14-15]。本实验发现萝卜硫素可明显增强Caspase-3/9活性，增高促凋亡蛋白cle-PARP和cle-Caspase-3表达，进而诱导A431细胞凋亡。
实验还研究了萝卜硫素诱导A431细胞凋亡的潜在分子机制。转录因子MiTF/TFE家族TFEB是肿瘤细胞存活和能量代谢的调节因子[16]。TFEB在细胞死亡中的作用仍然存在争议，有研究提出激活TFEB可防止酒精引起的脂肪变性和肝损伤[17];然而，也有研究指出诱导TFEB转录因子核移位，可通过提高溶酶体膜通透性触发细胞凋亡[18]。也有研究表明，TFEB被激活转移到细胞核，并通介导骨肉瘤细胞的死亡[19]。与上述研究结果类似，本实验发现萝卜硫素降低TFEB（Ser142）磷酸化水平，诱导TFEB表达，说明萝卜硫素可促使TFEB向核转移，进而诱导A431细胞凋亡。
MALAT1表达于多种肿瘤细胞，在多种皮肤癌疾病的发生发展过程中起重要作用[6-9]。此外，MALAT1信号通路激活还可促使胆囊癌细胞的增殖和转移[20]。本实验提示萝卜硫素降低MALAT1表达，并且MALAT1过表达降低了萝卜硫素对TFEB（Ser142）磷酸化水平和细胞活力的抑制作用。由此说明，萝卜硫素可通过调节MALAT1/TFEB信号传导介导A431细胞凋亡。综上所述，萝卜硫素可通过诱导A431细胞凋亡和抑制细胞增殖发挥抗肿瘤作用，其机制可能与抑制lncRNAMALAT1/TFEB信号通路活化有关。