观察胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)及其酪氨酸激酶受体RET在不同胎龄先天性肛门直肠畸形(ARM)胎鼠直肠末端的表达和分布情况,探讨其对ARM胎鼠直肠末端肠神经系统发育的影响。
方法SD孕鼠35只按简单随机法分为9 g/L盐水对照组(10只)和乙烯硫脲实验组(25只),2组孕鼠在孕16 d、孕18 d、孕20 d取出胎鼠,肉眼及解剖显微镜下将胎鼠分为9 g/L盐水对照组、乙烯硫脲对照组(未产生ARM胎鼠)、乙烯硫脲畸形组(ARM胎鼠)。应用HE染色观察各组胎鼠直肠末端肠神经节细胞形态并计数。应用免疫组织化学染色、Western blot法观察3组胎鼠在孕16 d、孕18 d、孕20 d直肠末端GDNF及受体RET分布情况。实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测3组胎鼠在孕16 d、孕18 d、孕20 d直肠末端GDNF mRNA的表达情况。
结果HE染色:3组胎鼠在孕16 d时肛门直肠末端各层发育不清晰,肌层见少量散在神经丛,细胞核小,分布稀疏,轴突及胞质少;在孕18 d和孕20 d时9 g/L盐水对照组、乙烯硫脲对照组胎鼠直肠末端浆膜层、肌层、黏膜下层、黏膜层及其腺体逐渐清晰可见,肌间及黏膜下神经丛逐渐增多(孕18 d:11.400±3.134、11.200±3.425;孕20 d:66.100±4.954、67.600±5.481),而乙烯硫脲畸形组层次不清,神经丛少(孕18 d:7.800±1.989;孕20 d:25.200±3.048),与2个对照组比较差异均有统计学意义(F=7.591、271.833,P均<0.05)。免疫组织化学染色结果:孕16 d时3组胎鼠GDNF及RET在肠壁各层表达尚不清晰,仅观察到极少量弱阳性细胞;在孕18 d和孕20 d时9 g/L盐水对照组和乙烯硫脲对照组直肠末端黏膜层、黏膜下及肌间神经丛中均有表达,随胚胎不断发育,表达强度逐渐增强,与2个对照组比较,差异均有统计学意义(P均<0.05)。qRT-PCR:在孕16 d 3组GDNF mRNA比较,差异无统计学意义(P>0.05);在孕18 d 9 g/L盐水对照组和乙烯硫脲对照组GDNF mRNA分别为103.624±27.533和105.184±19.634;孕20 d时9 g/L盐水对照组和乙烯硫脲对照组GDNF mRNA分别为151.496±33.622和150.738±21.423,与乙烯硫脲畸形组比较(孕18 d为79.169±11.697,孕20 d为94.873±11.309),差异均有统计学意义(P均<0.05)。
结论GDNF及其酪氨酸激酶受体RET在不同胎龄正常胎鼠与ARM胎鼠直肠末端表达均有一定的时间相关性;GDNF及其酪氨酸激酶受体RET在ARM胎鼠直肠末端表达的异常可能影响其肠神经系统发育。