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摘要 [目的]探究绵羊多羔性状候选基因CLSTN2、CCNB2、SRD5A2、HBEGF、FGFR1、GRIA2和FTH1在小尾寒羊性腺轴7种组织（大脑、小脑、下丘脑、垂体、子宫、卵巢、输卵管）中的表达情况，为阐明绵羊高繁殖力分子机理提供参考。[方法]以FecB BB型和++型小尾寒羊为研究对象，采用实时荧光定量PCR方法检测7个基因在性腺轴相关组织中的表达差异。[结果]CLSTN2基因在++型小尾寒羊卵巢中的表达量显著高于BB型小尾寒羊（P<0.05），SRD5A2基因在BB型小尾寒羊卵巢中的表达量显著高于++型小尾寒羊（P<0.05），FGFR1和FTH1基因在++型小尾寒羊子宫中的表达量显著高于BB型小尾寒羊（P<0.05），CCNB2、HBEGF和GRIA2基因在++型和BB型小尾寒羊性腺轴各组织中的表达量差异不显著（P>0.05）。[结论]CLSTN2、FGFR1和SRD5A2基因對小尾寒羊繁殖力具有一定的调控作用，其中SRD5A2基因对小尾寒羊的多羔性状具有一定的正向调节功能，而CLSTN2和FGFR1基因则呈现相反的调控作用。
关键词 绵羊;多羔;候选基因;性腺轴;表达差异
中图分类号 S 826 文献标识码 A
文章编号 0517-6611（2021）21-0118-06
doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.21.029
开放科学（资源服务）标识码（OSID）：
Expression Difference Analysis of 7 Genes in the Related Tissues of Gonadal Axis of Small Tail Han Sheep
ZHOU Zu-yang HE Xiao-yun LIU Yu-fang 2 et al
（1.Key Laboratory of Animal Genetics，Breeding and Reproduction of Ministry of Agriculture and Rural Affairs，Institute of Animal Sciences，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100193;2.College of Life Science and Food Engineering，Hebei University of Engineering，Handan，Hebei 056001）
Abstract [Objective] To explore the expression of multi-lamb candidate genes CLSTN CCNB SRD5A HBEGF，FGFR GRIA2 and FTH1 in 7 kinds of tissues （brain，cerebellum，hypothalamus，pituitary，uterus，ovary，fallopian tube） in the gonadal axis of Small Tail Han Sheep，and provide references for clarifying the molecular mechanism of sheep’s high fertility.[Method] Using FecB BB type and ++ type Small Tail Han Sheep as the research objects，real-time fluorescent quantitative PCR method was used to detect the expression differences of 7 genes in the related tissues of the gonadal axis.[Result]The relative expression level of CLSTN2 gene in ovary of ++ type Small Tail Han Sheep was significantly higher than that of BB type Small Tail Han Sheep（P<0.05），the relative expression level of SRD5A2 gene in ovary of BB type Small Tail Han Sheep was significantly higher than that of ++ type Small Tail Han Sheep（P<0.05），and the relative expression levels of FGFR1 gene and FTH1 gene in uterus of ++ type Small Tail Han Sheep were significantly higher than those of BB type Small Tail Han Sheep（P<0.05），while
the relative expression levels of CCNB2 gene，HBEGF gene and GRIA2 gene had no significant difference in different tissues of the gonadal axis of ++ type and BB type Small Tail Han Sheep （P>0.05）.[Conclusion]CLSTN FGFR1 and SRD5A2 genes might have some regulations on the fecundity of Small Tail Han Sheep.Among them，SRD5A2 gene might have some positive regulation functions on multi-lambing traits of Small Tail Han Sheep，while CLSTN2 gene and FGFR1 gene showed an opposite regulation effect. Key words Sheep;Multiple lambs;Candidate gene;Gonadal axis;Expression difference
基金项目 国家自然科学基金项目（31772580）;国家肉羊产业技术体系专项（CARS-38）;中国农业科学院科技创新工程项目（ASTIP-IAS13）。
作者简介 周祖阳（1994—），男，湖北鄂州人，硕士研究生，研究方向：动物遗传育种。*通信作者，刘玉芳，讲师，博士，从事动物遗传育种研究;储明星，研究员，博士，从事肉羊遗传育种研究。
收稿日期 2021-01-31
多羔性状是绵羊重要的繁殖性状之一，提高每胎的产羔数是提升绵羊养殖经济效益的有效方法[1]，因此对绵羊多羔性状候选基因的研究具有重要意义。大量研究表明，雌性动物繁殖性能主要受下丘脑-垂体-性腺轴（hypothalamic-pituitary-gonadal axis，HPGA）的调控，HPGA的相关基因是研究动物繁殖性状的重要候选基因[2]。近年来，随着分子实验技术的不断发展，绵羊多羔性状主效基因也陆续被发现，利用分子标记对绵羊多羔性状相关候选基因进行基因型选择，取得了重大进展。首先，通过对绵羊多羔主效控制基因FecB的研究发现，携带该基因的母羊在排卵数方面存在剂量效应，表现为每增加一个拷贝数，其排卵数可增加1.5个，产羔数可增加1.0～1.5个[3-4]，该基因的发现为选育高繁殖力母羊提供了研究方向。随着研究的不断深入，研究人员发现钙同线蛋白2（calsyntenin CLSTN2）、细胞周期蛋白B2（cyclin B CCNB2）、类固醇5α-还原酶2（steroid 5 alpha-reductase SRD5A2）、肝素结合表皮生长因子（heparin-binding epidermal growth factor-like growth factor，HBEGF）、成纤维细胞生长因子受体1（fibroblast growth factor receptor FGFR1）、谷氨酸AMPA离子通道受体2亚基（glutamate ionotropic receptor AMPA type subunit GRIA2）和铁蛋白重链多肽1 （ferritin heavy polypeptide FTH1）等基因均能影响绵羊的繁殖力。探究这些基因在野生型、突变型绵羊性腺轴相关组织中的表达量变化对于阐明绵羊多羔性状的分子机理具有重要意义。
Calsyntenins （CLSTNs） 蛋白家族是一类跨膜胞转运蛋白，主要分布在兴奋性神经元突触后膜。在脊椎动物中，CLSTNs家族包括CLSTN1、CLSTN2和CLSTN3三个成员[5]。Hernndez-montiel等[6]对2组佩利布伊绵羊进行了全基因组关联分析（GWAS）研究，基于GWAS结果的功能分析筛选出参与母羊卵巢发育过程的候选基因CLSTN 表明该基因可能参与了对该品种绵羊的繁殖力调控。CCNB2是细胞周期蛋白家族的一个成员，在细胞周期调控中起着重要作用[7]。Wang等[8]研究表明，在繁殖性状上，CCNB2能影响卵母细胞的发育;Mourot等[9]研究表明，CCNB2与牛卵母细胞的发育能力显著相关，推测该基因可能通过参与卵母细胞的发育调控绵羊的繁殖力。类固醇5α还原酶（SRD5A）包括1型和2型5α还原酶，催化睾酮生成二氢睾酮，在性别分化和雄激素介导的生理过程中起重要作用，在筛选单羔和多羔的安徽白山羊（AWG）卵巢差异表达基因的基础上，确定了SRD5A2基因是单羔和多羔AWG中差异表达最显著的基因，表明这个基因可能与山羊高繁殖力有关[10]。肝素结合性表皮生长因子（HBEGF）是最早发现的胚泡着床的分子介质之一，它在子宫内膜和植入滋养层细胞之间传递信号，以同步它们相应的发育进程。Jessmon等[11]认为该基因可以促进人和小鼠胚胎着床，有望在整个妊娠过程中作为生存因素发挥重要作用。成纤维细胞生长因子（FGF）对于促性腺激素释放激素（GnRH）系统的发育至关重要[12]，已有研究表明人类和啮齿动物都依赖FGF受体1（FGFR1）和FGF8来支持GnRH神经元的发育[13–15]，而GnRH水平的增加激活了下丘脑-垂体-性腺（HPG）轴，启动了雌激素依赖性变化，如阴道开放（VO）和发情周期的开始[16]。GRIA2是谷氨酸AMPA受体的一种亚型，也是中枢神经系统中最丰富的谷氨酸受体[17]。Vastagh等[18]研究发现，GRIA2基因参与调节促性腺激素释放激素（GnRH）的谷氨酸能途径，这是随后的激素级联反应诱发小鼠排卵的已知先决条件。铁蛋白重链多肽1 （FTH1）为铁蛋白复合物，编码铁蛋白重链亚基[19]。杨宏星[20]通过对猪卵泡腔形成的分子筛选研究发现，FTH1基因可能与卵泡囊腔的形成密切相关。
目前关于以上7个基因在小尾寒羊性腺轴相关组织中的表达分析尚未见报道。笔者以FecB BB型（突变型）和++型（野生型）卵泡期的小尾寒羊为研究对象，通过实时荧光定量PCR技术检测CLSTN2、CCNB2、SRD5A2、HBEGF、FGFR1、GRIA2和FTH1基因在绵羊性腺轴上相关组织中的表达量差异，旨在为进一步研究这7个基因对绵羊多羔性状的影响提供理论依据，为阐明绵羊高繁殖力机理提供参考。
1 材料与方法
1.1 试验动物和组织样的采集 所有试验用羊均于2017年10月饲养于天津市畜牧兽医研究所试验羊场。选取2～3周岁经产且健康状况良好的小尾寒羊母羊6只[FecB BB型（突变型）和++型（野生型）卵泡期各3只]，所有试验羊的饲粮水平和饲养环境均相同。2017年11月进行屠宰试验，取其大脑、小脑、下丘脑、垂体、子宫、卵巢、输卵管等组织，取样后迅速装入1.8 mL RNase-Free冻存管中（最大样品量为冻存管体积的67%）。所有羊的组织样品采集均在30 min内完成，样品采完后迅速放入液氮中冷冻保存，然后置于干冰中帶回实验室，放入-80 ℃冰箱中冷冻保存，备用。 1.2 RNA的提取及质量检测 将采集的小尾寒羊性腺轴7种相关组织在液氮中进行研磨，然后用Trizol试剂（Invitrogen，美国）进行裂解，并根据动物组织总RNA提取试剂盒（天根，北京）的说明书进行总RNA的提取，最后用1.0%琼脂糖凝胶电泳和Nanodrop 2000检测提取RNA的质量和浓度。经检验合格的组织总RNA置于-80 ℃下保存备用。
1.3 cDNA合成 用TaKaRa公司的反转录试剂盒反转录合成cDNA，反转录体系（总体积为20 μL）如下：5×PrimeScript Buffer 4.0 μL，PrimeScript RT Enzyme MixⅠ 1.0 μL，Oligo dT Primer 1.0 μL，Random 6 mers 1.0 μL，RNA 1.0 μg，用RNase-Free ddH2O补至20 μL。反转录反应条件如下：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，以获得cDNA第一链，试验操作全程在冰上进行，对反转录获得的cDNA进行5倍稀释，用持家基因RPL-19进行PCR检测，将符合标准的cDNA置于-20 ℃下保存，以用于检测目的基因的表达[2]。
1.4 荧光定量PCR引物设计 根据GenBank数据库提供的绵羊CLSTN2、CCNB2、SRD5A2、HBEGF、FGFR1、GRIA2、FTH1和RPL-19基因序列（登录号分别为XM_027963951.1、XM_004010560.4、XM_027966967.1、XM_004008863.4、XM_027962633.1、XM_004017287.4、NM_001009786.2）信息，用Primer Premier 5.0软件进行引物设计，其中RPL-19作为持家基因。引物由北京天一辉远生物科技有限公司合成。各引物浓度均为10 μmol/L，其他详细信息见表1。
1.5 实时荧光定量PCR 实时荧光定量PCR检测使用Roche Light Cycler480Ⅱ 型荧光定量PCR仪进行。以RPL-19基因为持家基因，每个样品重复检测3次。反应体系（总体积为20 μL）如下：SYBR Premix Ex Taq Ⅱ 10.0 μL，上、下游引物各0.8 μL，cDNA 模板2.0 μL，RNase-Free ddH2O 6.4 μL。PCR反应程序如下：95 ℃ 预变性5 s，95 ℃变性10 s，60 ℃ 30 s，45个循环;反应结束后，对熔解曲线进行分析。
1.6 标准曲线的建立 将cDNA样本稀释5倍，然后进行2倍梯度稀释后获得5个浓度梯度（1、1/2、1/4、1/8、1/16）的cDNA样品。以这些cDNA为模板，对目的基因和持家基因进行荧光定量PCR，以浓度梯度的对数值（以10为底数）为横坐标，以检测所得Ct值为纵坐标，绘制目的基因和持家基因的标准曲线[2]。
1.7 数据统计与分析 采用2-ΔΔCt法计算目的基因的相对表达量，数据差异显著性用SPSS 19.0软件进行统计与分析，组间比较用单因素方差分析（One-Way ANOVA），用最小显著差异法（LSD）进行多重比较，P<0.05表示差异显著，P<0.01表示差异极显著。
2 结果与分析
2.1 总RNA的提取 提取后的总RNA用1%琼脂糖凝胶电泳进行检测，结果发现28S条带明显比18S条带更亮，条带完整性较好，表明该RNA质量合格，可用于后续试验。
2.2 CLSTN2、CCNB2、SRD5A2、HBEGF、FGFR1、GRIA2和FTH1组织表达分析
2.2.1 CLSTN2组织表达分析。实时荧光定量PCR结果表明，CLSTN2基因在BB型小尾寒羊大脑中的相对表达量最高，其在++型和BB型小尾寒羊子宫中低表达。CLSTN2基因在++型小尾寒羊卵巢中的表达量显著高于BB型小尾寒羊（P<0.05） （图1）。
2.2.6 GRIA2组织表达分析。GRIA2基因在++型和BB型小尾寒羊大脑中的相对表达量最高，在++型和BB型小尾寒羊卵巢、子宫、输卵管中的相对表达量较低。GRIA2基因在++型和BB型小尾寒羊性腺轴各组织中的表达差异均不显著（图6）。
2.2.7 FTH1组织表达分析。FTH1基因在++型小尾寒羊下丘脑中的相对表达量最高，在++型和BB型小尾寒羊垂体、子宫、卵巢、输卵管中的相对表达量较低。FTH1基因在++型小尾寒羊子宫中的相对表达量极显著高于BB型小尾寒羊（P<0.01）（图7）。
3 讨论
卵巢、子宫等是动物最重要的繁殖器官，探究影响繁殖相关基因在这些组织中的表达差异可为阐明其产羔数和繁殖力提供理论基础[21]。CLSTN2（Calsyntenin2），也被称为alcadein-γ，是一种神经细胞表面突触蛋白。研究发现，在未成熟的大鼠子宫中，当17β-雌二醇（E2）水平在发情周期中升高时CLSTN2基因在卵泡期的表达量有所增加[22]。该试验中CLSTN2在BB型小尾寒羊大脑中的相对表达量最高，与++型小尾寒羊相比差异不显著（P>0.05）。Hernndez-montiel等[6]通过染色体全基因组关联分析、性状和与繁殖力相关的生物学通路来鉴定SNPs，结果发现CLSTN2基因s09883.1处的突变在佩利布伊绵羊中表现出非季节性繁殖的特点，而在该试验中CLSTN2基因在++型小尾寒羊卵巢组织中的相对表达量显著高于BB型小尾寒羊（P<0.05），推测该基因可能对FecB基因型小尾寒羊的產羔性状有一定的负调控作用，而这种差异可能是由于物种不同所致。CCNB2是一种细胞周期蛋白，它可以在减数分裂调节中发挥作用[23]。Daldello等[24]研究了CCNB2基因在小鼠卵母细胞减数分裂过程中的作用，结果发现缺乏CCNB2的卵母细胞成熟受到影响，导致了这些小鼠的不育，因此CCNB2在小鼠卵母细胞减数分裂过程中起着重要作用。Wang等[8]研究发现，在生殖性状上CCNB2能影响卵母细胞的发育。该试验中CCNB2基因在++型和BB型小尾寒羊卵巢中的相对表达量较高，其在++型小尾寒羊卵巢中的相对表达量略高于BB型小尾寒羊，二者差异不显著（P>0.05），推测该基因可能对小尾寒羊多羔性状的影响并不明显。SRD5A2基因编码生成5-α还原酶 其生物学功能是特异性催化睾酮转化为双氢睾酮[25]。Lian等[26]采用高通量RNA测序技术，筛选出高繁殖力和低繁殖力山羊卵巢中差异表达的长非编码RNA（LncRNAs）和mRNAs，KEGG通路分析表明差异表达的SRD5A2显著富集于类固醇激素的生物合成途径，而该途径与动物繁殖有关。Ling等[10]研究发现，SRD5A2在安徽白山羊和波尔山羊的卵巢中均有表达，但在心脏、肺脏、子宫和小肠中几乎没有表达，且SRD5A2基因是单产和多产安徽白山羊中差异表达最显著的基因，据此推测该基因可能与山羊的繁殖力有关。该试验中SR5AD2在BB型小尾寒羊卵巢中的相对表达量高于++型小尾寒羊，且二者差异显著（P<0.05），推测该基因对FecB基因型小尾寒羊单羔、多羔繁殖性状具有一定的正向调控作用。肝素结合性表皮生长因子（heparin binding EGF like growth factor，HBEGF）是表皮生长因子家族中的一员[27]，HBEGF基因参与了卵泡的发育。研究发现，大小卵泡中均有sHB-EGF和proHB-EGF的表达，但小卵泡中二者的比值明显高于大卵泡[28]。潘伯臣等[29]研究发现女性不孕患者在接受体外授精-胚胎移植过程中取得的黄素化颗粒细胞在体外培养条件下表达 HBEGF，说明 HBEGF 基因在卵泡发育及分化中发挥了一定的作用。该研究中HBEGF在BB型小尾寒羊小脑中的相对表达量最高，而在++型和BB型小尾寒羊垂体、卵巢、子宫中的相对表达量较低，推测该基因可能对小尾寒羊多羔性状的影响不大。 FGF信号在胎盘发育过程中起着重要作用，是滋养层干细胞（TSCs）从滋养外胚层分化所必需的[30]，而成纤维细胞生长因子（FGFs）通过4种成纤维细胞生长因子受体酪氨酸激酶（FGFR1-FGFR4）传递信号，并参与许多信号通路，包括ERK1/2、PLC和PI3K[31]。成纤维细胞生长因子（FGF）对于促性腺激素释放激素（GnRH）系统的发育至关重要[13-15]。Tata等[12]研究发现，相比于具有可见的、更有害的生殖缺陷的复合胚体，FGF8缺失型或FGFR1缺失型小鼠在第一个发情期仅表现出轻微延迟，并在第一个发情期后开始正常的周期，这表明GnRH神经元30%～40%的减少主要影响第一个发情周期的启动，但不影响其开始后的周期性。这与许多研究结果相一致，即只需要少数促性腺激素释放激素神经元来支持女性的青春期和持续生育能力[32-34]。据此推测FGF信号缺陷可能在不同程度上改变了雌性的发情周期和生育能力[12]。该试验中FGFR1基因在BB型小尾寒羊小脑中的相对表达量最高，且在++型小尾寒羊子宫中的相对表达量显著高于BB型小尾寒羊（P<0.05），推测FGFR1可能对小尾寒羊的产羔性状具有负调节的作用。GRIA2是谷氨酸AMPA受体的一种亚型，GRIA2亚基在控制异构体AMPAR通道的电流-电压关系和Ca2+渗透性等方面发挥着主导作用[35]。Wenthold 等[36]的免疫沉淀研究表明，与GRIA1或GRIA3相关的含有GRIA2的复合物是成人海马体中存在的主要AMPAR群体。Vastagh等[18]研究了神经递质信号转导相关基因mRNA表达的变化，发现谷氨酸能（GRIA1、GRIA2）等基因中的差异最为明显，这也导致了受体下游的G蛋白、腺苷酸环化酶和某些转运蛋白（SLC1A4、SLC17A6、SLC6A17）的基因表达也发生了变化。在卵巢周期的发情前期和发情后期，GnRH神经元神经递质信号转导相关基因表达的显著差异表明，这些神经递质系统对排卵前GnRH峰的诱导有不同的贡献，而排卵前GnRH峰是随后激素级联诱导排卵的已知前提。该试验中GRIA2基因在++型和BB型小尾寒羊的大脑中的相对表达量较高，推测该基因可能参与GnRH的分泌，从而促进小尾寒羊的排卵，进而调节繁殖活动，但该基因在2种基因型小尾寒羊性腺轴各组织中的表达差异并不显著（P>0.05），推测其对FecB基因型小尾寒羊的多羔性状无显著影响。铁蛋白重链多肽（FTH1）为铁蛋白复合物，它除了调节铁代谢外，还参与细胞增殖和胚胎发育，对动物的生长和繁殖产生影响。王丽等[19]研究表明FTH1基因g.163-5G>A 位点的突变与湖羊产羔数显著相关，推测FTH1基因可作为影响绵羊繁殖力的候选基因。Feng等[37]通过抑制性消减杂交技术筛选出与济宁青山羊多胎性有关的基因FTH 且该基因在成年济宁青山羊下丘脑组织中高表达，与该研究结果相一致，但该基因在++型和BB型小尾寒羊中的表达差异并不显著，此外FTH1基因在++型小尾寒羊子宫中的相对表达量极显著高于BB型小尾寒羊（P<0.01），在BB型小尾寒羊卵巢中的相对表达量高于++型小尾寒羊，但二者差异不显著，这可能是由于物种不同所造成的，因此推測该基因对FecB基因型小尾寒羊的多羔性状具有一定的影响。
4 结论
CLSTN2基因在++型小尾寒羊卵巢中的相对表达量显著高于BB型小尾寒羊（P<0.05），FGFR1基因在++型小尾寒羊子宫中的相对表达量显著高于BB型小尾寒羊（P<0.05），推测这些基因可能对小尾寒羊的多羔性状具有负调节的作用;SRD5A2基因在BB型小尾寒羊卵巢中的相对表达量显著高于++型小尾寒羊（P<0.05），推测该基因可能对绵羊的多羔性状具有一定的正向调节作用;FTH1基因在++型小尾寒羊子宫中的相对表达量极显著高于BB型小尾寒羊（P<0.01），而有关该基因对绵羊繁殖力的影响则有待进一步探究。该研究结果可为阐明绵羊高繁殖力的分子机制提供一定参考。
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关键词 绵羊;多羔;候选基因;性腺轴;表达差异
中图分类号 S 826 文献标识码 A
文章编号 0517-6611（2021）21-0118-06
doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.21.029
开放科学（资源服务）标识码（OSID）：
Expression Difference Analysis of 7 Genes in the Related Tissues of Gonadal Axis of Small Tail Han Sheep
ZHOU Zu-yang HE Xiao-yun LIU Yu-fang 2 et al
（1.Key Laboratory of Animal Genetics，Breeding and Reproduction of Ministry of Agriculture and Rural Affairs，Institute of Animal Sciences，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100193;2.College of Life Science and Food Engineering，Hebei University of Engineering，Handan，Hebei 056001）
Abstract [Objective] To explore the expression of multi-lamb candidate genes CLSTN CCNB SRD5A HBEGF，FGFR GRIA2 and FTH1 in 7 kinds of tissues （brain，cerebellum，hypothalamus，pituitary，uterus，ovary，fallopian tube） in the gonadal axis of Small Tail Han Sheep，and provide references for clarifying the molecular mechanism of sheep’s high fertility.[Method] Using FecB BB type and ++ type Small Tail Han Sheep as the research objects，real-time fluorescent quantitative PCR method was used to detect the expression differences of 7 genes in the related tissues of the gonadal axis.[Result]The relative expression level of CLSTN2 gene in ovary of ++ type Small Tail Han Sheep was significantly higher than that of BB type Small Tail Han Sheep（P<0.05），the relative expression level of SRD5A2 gene in ovary of BB type Small Tail Han Sheep was significantly higher than that of ++ type Small Tail Han Sheep（P<0.05），and the relative expression levels of FGFR1 gene and FTH1 gene in uterus of ++ type Small Tail Han Sheep were significantly higher than those of BB type Small Tail Han Sheep（P<0.05），while
the relative expression levels of CCNB2 gene，HBEGF gene and GRIA2 gene had no significant difference in different tissues of the gonadal axis of ++ type and BB type Small Tail Han Sheep （P>0.05）.[Conclusion]CLSTN FGFR1 and SRD5A2 genes might have some regulations on the fecundity of Small Tail Han Sheep.Among them，SRD5A2 gene might have some positive regulation functions on multi-lambing traits of Small Tail Han Sheep，while CLSTN2 gene and FGFR1 gene showed an opposite regulation effect. Key words Sheep;Multiple lambs;Candidate gene;Gonadal axis;Expression difference
基金项目 国家自然科学基金项目（31772580）;国家肉羊产业技术体系专项（CARS-38）;中国农业科学院科技创新工程项目（ASTIP-IAS13）。
作者简介 周祖阳（1994—），男，湖北鄂州人，硕士研究生，研究方向：动物遗传育种。*通信作者，刘玉芳，讲师，博士，从事动物遗传育种研究;储明星，研究员，博士，从事肉羊遗传育种研究。
收稿日期 2021-01-31
多羔性状是绵羊重要的繁殖性状之一，提高每胎的产羔数是提升绵羊养殖经济效益的有效方法[1]，因此对绵羊多羔性状候选基因的研究具有重要意义。大量研究表明，雌性动物繁殖性能主要受下丘脑-垂体-性腺轴（hypothalamic-pituitary-gonadal axis，HPGA）的调控，HPGA的相关基因是研究动物繁殖性状的重要候选基因[2]。近年来，随着分子实验技术的不断发展，绵羊多羔性状主效基因也陆续被发现，利用分子标记对绵羊多羔性状相关候选基因进行基因型选择，取得了重大进展。首先，通过对绵羊多羔主效控制基因FecB的研究发现，携带该基因的母羊在排卵数方面存在剂量效应，表现为每增加一个拷贝数，其排卵数可增加1.5个，产羔数可增加1.0～1.5个[3-4]，该基因的发现为选育高繁殖力母羊提供了研究方向。随着研究的不断深入，研究人员发现钙同线蛋白2（calsyntenin CLSTN2）、细胞周期蛋白B2（cyclin B CCNB2）、类固醇5α-还原酶2（steroid 5 alpha-reductase SRD5A2）、肝素结合表皮生长因子（heparin-binding epidermal growth factor-like growth factor，HBEGF）、成纤维细胞生长因子受体1（fibroblast growth factor receptor FGFR1）、谷氨酸AMPA离子通道受体2亚基（glutamate ionotropic receptor AMPA type subunit GRIA2）和铁蛋白重链多肽1 （ferritin heavy polypeptide FTH1）等基因均能影响绵羊的繁殖力。探究这些基因在野生型、突变型绵羊性腺轴相关组织中的表达量变化对于阐明绵羊多羔性状的分子机理具有重要意义。
Calsyntenins （CLSTNs） 蛋白家族是一类跨膜胞转运蛋白，主要分布在兴奋性神经元突触后膜。在脊椎动物中，CLSTNs家族包括CLSTN1、CLSTN2和CLSTN3三个成员[5]。Hernndez-montiel等[6]对2组佩利布伊绵羊进行了全基因组关联分析（GWAS）研究，基于GWAS结果的功能分析筛选出参与母羊卵巢发育过程的候选基因CLSTN 表明该基因可能参与了对该品种绵羊的繁殖力调控。CCNB2是细胞周期蛋白家族的一个成员，在细胞周期调控中起着重要作用[7]。Wang等[8]研究表明，在繁殖性状上，CCNB2能影响卵母细胞的发育;Mourot等[9]研究表明，CCNB2与牛卵母细胞的发育能力显著相关，推测该基因可能通过参与卵母细胞的发育调控绵羊的繁殖力。类固醇5α还原酶（SRD5A）包括1型和2型5α还原酶，催化睾酮生成二氢睾酮，在性别分化和雄激素介导的生理过程中起重要作用，在筛选单羔和多羔的安徽白山羊（AWG）卵巢差异表达基因的基础上，确定了SRD5A2基因是单羔和多羔AWG中差异表达最显著的基因，表明这个基因可能与山羊高繁殖力有关[10]。肝素结合性表皮生长因子（HBEGF）是最早发现的胚泡着床的分子介质之一，它在子宫内膜和植入滋养层细胞之间传递信号，以同步它们相应的发育进程。Jessmon等[11]认为该基因可以促进人和小鼠胚胎着床，有望在整个妊娠过程中作为生存因素发挥重要作用。成纤维细胞生长因子（FGF）对于促性腺激素释放激素（GnRH）系统的发育至关重要[12]，已有研究表明人类和啮齿动物都依赖FGF受体1（FGFR1）和FGF8来支持GnRH神经元的发育[13–15]，而GnRH水平的增加激活了下丘脑-垂体-性腺（HPG）轴，启动了雌激素依赖性变化，如阴道开放（VO）和发情周期的开始[16]。GRIA2是谷氨酸AMPA受体的一种亚型，也是中枢神经系统中最丰富的谷氨酸受体[17]。Vastagh等[18]研究发现，GRIA2基因参与调节促性腺激素释放激素（GnRH）的谷氨酸能途径，这是随后的激素级联反应诱发小鼠排卵的已知先决条件。铁蛋白重链多肽1 （FTH1）为铁蛋白复合物，编码铁蛋白重链亚基[19]。杨宏星[20]通过对猪卵泡腔形成的分子筛选研究发现，FTH1基因可能与卵泡囊腔的形成密切相关。
目前关于以上7个基因在小尾寒羊性腺轴相关组织中的表达分析尚未见报道。笔者以FecB BB型（突变型）和++型（野生型）卵泡期的小尾寒羊为研究对象，通过实时荧光定量PCR技术检测CLSTN2、CCNB2、SRD5A2、HBEGF、FGFR1、GRIA2和FTH1基因在绵羊性腺轴上相关组织中的表达量差异，旨在为进一步研究这7个基因对绵羊多羔性状的影响提供理论依据，为阐明绵羊高繁殖力机理提供参考。
1 材料与方法
1.1 试验动物和组织样的采集 所有试验用羊均于2017年10月饲养于天津市畜牧兽医研究所试验羊场。选取2～3周岁经产且健康状况良好的小尾寒羊母羊6只[FecB BB型（突变型）和++型（野生型）卵泡期各3只]，所有试验羊的饲粮水平和饲养环境均相同。2017年11月进行屠宰试验，取其大脑、小脑、下丘脑、垂体、子宫、卵巢、输卵管等组织，取样后迅速装入1.8 mL RNase-Free冻存管中（最大样品量为冻存管体积的67%）。所有羊的组织样品采集均在30 min内完成，样品采完后迅速放入液氮中冷冻保存，然后置于干冰中帶回实验室，放入-80 ℃冰箱中冷冻保存，备用。 1.2 RNA的提取及质量检测 将采集的小尾寒羊性腺轴7种相关组织在液氮中进行研磨，然后用Trizol试剂（Invitrogen，美国）进行裂解，并根据动物组织总RNA提取试剂盒（天根，北京）的说明书进行总RNA的提取，最后用1.0%琼脂糖凝胶电泳和Nanodrop 2000检测提取RNA的质量和浓度。经检验合格的组织总RNA置于-80 ℃下保存备用。
1.3 cDNA合成 用TaKaRa公司的反转录试剂盒反转录合成cDNA，反转录体系（总体积为20 μL）如下：5×PrimeScript Buffer 4.0 μL，PrimeScript RT Enzyme MixⅠ 1.0 μL，Oligo dT Primer 1.0 μL，Random 6 mers 1.0 μL，RNA 1.0 μg，用RNase-Free ddH2O补至20 μL。反转录反应条件如下：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，以获得cDNA第一链，试验操作全程在冰上进行，对反转录获得的cDNA进行5倍稀释，用持家基因RPL-19进行PCR检测，将符合标准的cDNA置于-20 ℃下保存，以用于检测目的基因的表达[2]。
1.4 荧光定量PCR引物设计 根据GenBank数据库提供的绵羊CLSTN2、CCNB2、SRD5A2、HBEGF、FGFR1、GRIA2、FTH1和RPL-19基因序列（登录号分别为XM_027963951.1、XM_004010560.4、XM_027966967.1、XM_004008863.4、XM_027962633.1、XM_004017287.4、NM_001009786.2）信息，用Primer Premier 5.0软件进行引物设计，其中RPL-19作为持家基因。引物由北京天一辉远生物科技有限公司合成。各引物浓度均为10 μmol/L，其他详细信息见表1。
1.5 实时荧光定量PCR 实时荧光定量PCR检测使用Roche Light Cycler480Ⅱ 型荧光定量PCR仪进行。以RPL-19基因为持家基因，每个样品重复检测3次。反应体系（总体积为20 μL）如下：SYBR Premix Ex Taq Ⅱ 10.0 μL，上、下游引物各0.8 μL，cDNA 模板2.0 μL，RNase-Free ddH2O 6.4 μL。PCR反应程序如下：95 ℃ 预变性5 s，95 ℃变性10 s，60 ℃ 30 s，45个循环;反应结束后，对熔解曲线进行分析。
1.6 标准曲线的建立 将cDNA样本稀释5倍，然后进行2倍梯度稀释后获得5个浓度梯度（1、1/2、1/4、1/8、1/16）的cDNA样品。以这些cDNA为模板，对目的基因和持家基因进行荧光定量PCR，以浓度梯度的对数值（以10为底数）为横坐标，以检测所得Ct值为纵坐标，绘制目的基因和持家基因的标准曲线[2]。
1.7 数据统计与分析 采用2-ΔΔCt法计算目的基因的相对表达量，数据差异显著性用SPSS 19.0软件进行统计与分析，组间比较用单因素方差分析（One-Way ANOVA），用最小显著差异法（LSD）进行多重比较，P<0.05表示差异显著，P<0.01表示差异极显著。
2 结果与分析
2.1 总RNA的提取 提取后的总RNA用1%琼脂糖凝胶电泳进行检测，结果发现28S条带明显比18S条带更亮，条带完整性较好，表明该RNA质量合格，可用于后续试验。
2.2 CLSTN2、CCNB2、SRD5A2、HBEGF、FGFR1、GRIA2和FTH1组织表达分析
2.2.1 CLSTN2组织表达分析。实时荧光定量PCR结果表明，CLSTN2基因在BB型小尾寒羊大脑中的相对表达量最高，其在++型和BB型小尾寒羊子宫中低表达。CLSTN2基因在++型小尾寒羊卵巢中的表达量显著高于BB型小尾寒羊（P<0.05） （图1）。
2.2.6 GRIA2组织表达分析。GRIA2基因在++型和BB型小尾寒羊大脑中的相对表达量最高，在++型和BB型小尾寒羊卵巢、子宫、输卵管中的相对表达量较低。GRIA2基因在++型和BB型小尾寒羊性腺轴各组织中的表达差异均不显著（图6）。
2.2.7 FTH1组织表达分析。FTH1基因在++型小尾寒羊下丘脑中的相对表达量最高，在++型和BB型小尾寒羊垂体、子宫、卵巢、输卵管中的相对表达量较低。FTH1基因在++型小尾寒羊子宫中的相对表达量极显著高于BB型小尾寒羊（P<0.01）（图7）。
3 讨论
卵巢、子宫等是动物最重要的繁殖器官，探究影响繁殖相关基因在这些组织中的表达差异可为阐明其产羔数和繁殖力提供理论基础[21]。CLSTN2（Calsyntenin2），也被称为alcadein-γ，是一种神经细胞表面突触蛋白。研究发现，在未成熟的大鼠子宫中，当17β-雌二醇（E2）水平在发情周期中升高时CLSTN2基因在卵泡期的表达量有所增加[22]。该试验中CLSTN2在BB型小尾寒羊大脑中的相对表达量最高，与++型小尾寒羊相比差异不显著（P>0.05）。Hernndez-montiel等[6]通过染色体全基因组关联分析、性状和与繁殖力相关的生物学通路来鉴定SNPs，结果发现CLSTN2基因s09883.1处的突变在佩利布伊绵羊中表现出非季节性繁殖的特点，而在该试验中CLSTN2基因在++型小尾寒羊卵巢组织中的相对表达量显著高于BB型小尾寒羊（P<0.05），推测该基因可能对FecB基因型小尾寒羊的產羔性状有一定的负调控作用，而这种差异可能是由于物种不同所致。CCNB2是一种细胞周期蛋白，它可以在减数分裂调节中发挥作用[23]。Daldello等[24]研究了CCNB2基因在小鼠卵母细胞减数分裂过程中的作用，结果发现缺乏CCNB2的卵母细胞成熟受到影响，导致了这些小鼠的不育，因此CCNB2在小鼠卵母细胞减数分裂过程中起着重要作用。Wang等[8]研究发现，在生殖性状上CCNB2能影响卵母细胞的发育。该试验中CCNB2基因在++型和BB型小尾寒羊卵巢中的相对表达量较高，其在++型小尾寒羊卵巢中的相对表达量略高于BB型小尾寒羊，二者差异不显著（P>0.05），推测该基因可能对小尾寒羊多羔性状的影响并不明显。SRD5A2基因编码生成5-α还原酶 其生物学功能是特异性催化睾酮转化为双氢睾酮[25]。Lian等[26]采用高通量RNA测序技术，筛选出高繁殖力和低繁殖力山羊卵巢中差异表达的长非编码RNA（LncRNAs）和mRNAs，KEGG通路分析表明差异表达的SRD5A2显著富集于类固醇激素的生物合成途径，而该途径与动物繁殖有关。Ling等[10]研究发现，SRD5A2在安徽白山羊和波尔山羊的卵巢中均有表达，但在心脏、肺脏、子宫和小肠中几乎没有表达，且SRD5A2基因是单产和多产安徽白山羊中差异表达最显著的基因，据此推测该基因可能与山羊的繁殖力有关。该试验中SR5AD2在BB型小尾寒羊卵巢中的相对表达量高于++型小尾寒羊，且二者差异显著（P<0.05），推测该基因对FecB基因型小尾寒羊单羔、多羔繁殖性状具有一定的正向调控作用。肝素结合性表皮生长因子（heparin binding EGF like growth factor，HBEGF）是表皮生长因子家族中的一员[27]，HBEGF基因参与了卵泡的发育。研究发现，大小卵泡中均有sHB-EGF和proHB-EGF的表达，但小卵泡中二者的比值明显高于大卵泡[28]。潘伯臣等[29]研究发现女性不孕患者在接受体外授精-胚胎移植过程中取得的黄素化颗粒细胞在体外培养条件下表达 HBEGF，说明 HBEGF 基因在卵泡发育及分化中发挥了一定的作用。该研究中HBEGF在BB型小尾寒羊小脑中的相对表达量最高，而在++型和BB型小尾寒羊垂体、卵巢、子宫中的相对表达量较低，推测该基因可能对小尾寒羊多羔性状的影响不大。 FGF信号在胎盘发育过程中起着重要作用，是滋养层干细胞（TSCs）从滋养外胚层分化所必需的[30]，而成纤维细胞生长因子（FGFs）通过4种成纤维细胞生长因子受体酪氨酸激酶（FGFR1-FGFR4）传递信号，并参与许多信号通路，包括ERK1/2、PLC和PI3K[31]。成纤维细胞生长因子（FGF）对于促性腺激素释放激素（GnRH）系统的发育至关重要[13-15]。Tata等[12]研究发现，相比于具有可见的、更有害的生殖缺陷的复合胚体，FGF8缺失型或FGFR1缺失型小鼠在第一个发情期仅表现出轻微延迟，并在第一个发情期后开始正常的周期，这表明GnRH神经元30%～40%的减少主要影响第一个发情周期的启动，但不影响其开始后的周期性。这与许多研究结果相一致，即只需要少数促性腺激素释放激素神经元来支持女性的青春期和持续生育能力[32-34]。据此推测FGF信号缺陷可能在不同程度上改变了雌性的发情周期和生育能力[12]。该试验中FGFR1基因在BB型小尾寒羊小脑中的相对表达量最高，且在++型小尾寒羊子宫中的相对表达量显著高于BB型小尾寒羊（P<0.05），推测FGFR1可能对小尾寒羊的产羔性状具有负调节的作用。GRIA2是谷氨酸AMPA受体的一种亚型，GRIA2亚基在控制异构体AMPAR通道的电流-电压关系和Ca2+渗透性等方面发挥着主导作用[35]。Wenthold 等[36]的免疫沉淀研究表明，与GRIA1或GRIA3相关的含有GRIA2的复合物是成人海马体中存在的主要AMPAR群体。Vastagh等[18]研究了神经递质信号转导相关基因mRNA表达的变化，发现谷氨酸能（GRIA1、GRIA2）等基因中的差异最为明显，这也导致了受体下游的G蛋白、腺苷酸环化酶和某些转运蛋白（SLC1A4、SLC17A6、SLC6A17）的基因表达也发生了变化。在卵巢周期的发情前期和发情后期，GnRH神经元神经递质信号转导相关基因表达的显著差异表明，这些神经递质系统对排卵前GnRH峰的诱导有不同的贡献，而排卵前GnRH峰是随后激素级联诱导排卵的已知前提。该试验中GRIA2基因在++型和BB型小尾寒羊的大脑中的相对表达量较高，推测该基因可能参与GnRH的分泌，从而促进小尾寒羊的排卵，进而调节繁殖活动，但该基因在2种基因型小尾寒羊性腺轴各组织中的表达差异并不显著（P>0.05），推测其对FecB基因型小尾寒羊的多羔性状无显著影响。铁蛋白重链多肽（FTH1）为铁蛋白复合物，它除了调节铁代谢外，还参与细胞增殖和胚胎发育，对动物的生长和繁殖产生影响。王丽等[19]研究表明FTH1基因g.163-5G>A 位点的突变与湖羊产羔数显著相关，推测FTH1基因可作为影响绵羊繁殖力的候选基因。Feng等[37]通过抑制性消减杂交技术筛选出与济宁青山羊多胎性有关的基因FTH 且该基因在成年济宁青山羊下丘脑组织中高表达，与该研究结果相一致，但该基因在++型和BB型小尾寒羊中的表达差异并不显著，此外FTH1基因在++型小尾寒羊子宫中的相对表达量极显著高于BB型小尾寒羊（P<0.01），在BB型小尾寒羊卵巢中的相对表达量高于++型小尾寒羊，但二者差异不显著，这可能是由于物种不同所造成的，因此推測该基因对FecB基因型小尾寒羊的多羔性状具有一定的影响。
4 结论
CLSTN2基因在++型小尾寒羊卵巢中的相对表达量显著高于BB型小尾寒羊（P<0.05），FGFR1基因在++型小尾寒羊子宫中的相对表达量显著高于BB型小尾寒羊（P<0.05），推测这些基因可能对小尾寒羊的多羔性状具有负调节的作用;SRD5A2基因在BB型小尾寒羊卵巢中的相对表达量显著高于++型小尾寒羊（P<0.05），推测该基因可能对绵羊的多羔性状具有一定的正向调节作用;FTH1基因在++型小尾寒羊子宫中的相对表达量极显著高于BB型小尾寒羊（P<0.01），而有关该基因对绵羊繁殖力的影响则有待进一步探究。该研究结果可为阐明绵羊高繁殖力的分子机制提供一定参考。
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