【摘 要】
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目的 研究SHARP-2(rat enhancer of split-and hairy-related protein-2)特异性基因沉默后对白细胞介素2(IL-2)和γ干扰素(IFN-γ)基因表达及肾移植受者大鼠存活时间的影响.方法 采用基因重组、转染、共转染等分子生物学方法将针对SHARP-2的短发夹式RNA干扰序列导入到第3代自失活慢病毒载体ViraPower packaging mix,
【机 构】
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10003,杭州,浙江大学医学院附属第一医院肾脏病中心10003,杭州,浙江大学医学院附属第一医院卫生部多器官联合移植重点实验室;浙江大学医学院附属第一医院卫生部多器官联合移植重点实验室,杭州,100
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目的 研究SHARP-2(rat enhancer of split-and hairy-related protein-2)特异性基因沉默后对白细胞介素2(IL-2)和γ干扰素(IFN-γ)基因表达及肾移植受者大鼠存活时间的影响.方法 采用基因重组、转染、共转染等分子生物学方法将针对SHARP-2的短发夹式RNA干扰序列导入到第3代自失活慢病毒载体ViraPower packaging mix,以构建重组慢病毒;有限稀释法确定病毒滴度;实时定量PCR法研究基因表达变化;原位大鼠肾移植模型研究SHARP-2基因沉默后受者存活间变化.结果 在正常大鼠肾脏细胞中,重组慢病毒LV-SHARP-2iC对SHARP-2的基因沉默效率达84%.在复感染指数(MOI)=20时,用spinoculation 法可使57%的T细胞受转染.在活化T细胞中,SHARP-2基因沉默后对IL-2和IFN-γ的基因表达抑制率分别达61.3%和68.7%.和空白对照以及随意序列对照组相比,5×10TU SHARP-2特异的RNA干扰重组慢病毒LV-SHARP-2iC灌汴供肾后,肾移植受者大鼠的中位存活时间延长4～5 d.移植肾局部组织分析发现SHARP-2基因沉默效果达61%,IL一2和IFN-γ的基因表达则分别下降了47.3%和58.2%.结论 成功构建了以第3代自失活慢病毒为载体的、针对SHARP-2基因的短发夹式RNA干扰重组病毒LV-SHARP-2iC,该体系能使SHARP-2基因表达有效沉默,进而抑制活化T细胞中与排斥相关的IL-2和IFN-γ的基因表达,在肾移植模型中延长受者大鼠存活时间.
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