【摘 要】
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目的 采用改良的λRed同源重组技术,以减毒沙门菌TT-16(△clpP TT-1)为前体菌,构建敲除yejE基因的减毒沙门菌TT-54(△clpP △yejETT-1),为后续研究yejE基因的功能奠定基础.方
【机 构】
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四川大学华西公共卫生学院(华西第四医院),四川成都610041
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目的 采用改良的λRed同源重组技术,以减毒沙门菌TT-16(△clpP TT-1)为前体菌,构建敲除yejE基因的减毒沙门菌TT-54(△clpP △yejETT-1),为后续研究yejE基因的功能奠定基础.方法 (1)将重组质粒PKD46导入减毒沙门菌TT-16(△clpP TT-1),获得一次重组受体菌TT-51(△clpP PKD46 TT-1);(2)通过PCR扩增获得yejE基因的一次同源重组打靶片段,将其导入TT-51(△clpP PKD46 TT-1),利用四环素平板筛选,获得重组菌TT-52(△clpP △yejE::tetRA TT-1);(3)将重组质粒PKD46导入重组菌TT-52,获得同源重组受体菌TT-53(△clpP △yejE::tetRA PKD46 TT-1);(4)将PCR扩增获得的yejE基因二次同源重组打靶片段导入TT-53(△clpP △yejE::tetRA PKD46 TT-1),通过四环素敏感平板筛选,获得敲除了yejE基因的减毒沙门菌TT-54(△clpP △yejE TT-1).结果 通过两轮(一次和二次)λRed同源重组,减毒沙门菌TT-16(△clpP TT-1)的yejE基因被成功敲除,PCR及测序鉴定结果符合预期.结论 基于模式菌(大肠杆菌)所构建的λRed同源重组技术完全适用于沙门菌;通过两轮λRed同源重组,可实现对沙门菌特定靶基因的无痕敲除.
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