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【摘要】 目的：优选出补骨脂中总黄酮的最佳提取条件。 方法：采用均匀设计试验的方法，以所得总黄酮产量为考察指标，对影响总黄酮提取工艺的因素进行了研究。结果：乙醇浓度、料料液比和提取时间对其均有明显影响。结论：补骨脂中总黄酮的提取工艺为乙醇浓度92%，料液比为9.5倍，提取时间为100min。
【关键词】 补骨脂；总黄酮；提取工艺；均匀实验
补骨脂为豆科植物补骨脂(Psoralea corylifolia L)的干燥成熟果实，是一味常用中药，其味辛苦、性温，具有温肾助阳、温中止泻之功效。现代药理研究表明补骨脂有舒张支气管平滑肌、抗衰老、抗菌、抗肿瘤和扩张冠状动脉的作用[1-3]。另有研究表明补骨脂中的黄酮类成分可能具有防止骨吸收、增加骨密度的雌激素样作用[4]。香豆素类和黄酮类是补骨脂中的主要有效成分，目前科研工作者较多进行的是补骨脂中香豆素类的提取分离，而对于黄酮类的研究尚少，因此我们对补骨脂中的黄酮类的提取方法进行了探索，以期进一步对其药理作用进行研究。
1实验仪器与试剂
HH-S型水浴锅，巩义市英峪予华仪器厂；SHZ-95型循环水式多用真空泵，巩义市杜甫仪器厂；分析天平,梅特勒AE240电子分析天平；倾斜式高速万能粉碎机，北京中兴伟业仪器有限公司；补骨脂，市售药材，经河南中医学院生药学科鉴定为豆科植物补骨脂；试剂均为分析纯。
2实验方法
2.1提取方法与结果
考虑到黄酮类在乙醇和氯仿中溶解度较好，所以我们分别选用了乙醇和氯仿作为溶剂进行回流提取，并与水提法进行了比较。
2.1.1 乙醇回流提取法：将补骨脂粉碎成细粉，取200g均分成4份，加入80%，70%，60%，50%乙醇溶液200ml浸泡过夜，次日水浴回流提取30min，用脱脂棉过滤，滤液回收乙醇至无醇味，混悬液放置过夜，次日分层，倾去水层，用少量水洗去粘稠性杂质，得黑色膏状物，加氯仿1:1热溶，滤过，滤液用5% Na2CO3萃取三次，合并，加盐酸调pH至酸性，溶液析出沉淀，抽滤，即得黄酮粗品[5、6]。
2.1.2 氯仿回流提取法：补骨脂粉50g，加氯仿于水浴70℃上回流提取1h，脱脂棉过滤，得滤液，加入碳酸氢钠溶液除去带羧基的有机酸杂质，再5%Na2CO3溶液1:1分别萃取三次，合并萃取液，加盐酸调pH至溶液pH2~3，析出沉淀，抽滤，得到黄酮粗品[7、8]。
2.1.3碱溶酸沉法：补骨脂粉50g，加入100ml5%Na2CO3溶液浸泡1h，脱脂棉过滤，滤液加盐酸调pH至酸性，即析出沉淀，抽滤,即得总黄酮粗品。
2.1.4煎煮法：补骨脂粉50g，0.2%NaOH溶液150ml电炉上煮沸1h，香豆素内酯环开环并改变构象，脱脂棉过滤，滤液加盐酸调PH至酸性，析出沉淀，抽滤，将沉淀溶于碳酸氢钠溶液，至不再溶解为度，抽滤,即得总黄酮，既排除了有机酸的干扰，又出去了香豆素的不同构象衍生物。
2.1.5结果：实验结果表明氯仿作为溶剂回流所得总黄酮产率较之乙醇低，且氯仿价格较贵，毒性较大；水提法较之回流法效率差，杂质多，故我们选择了乙醇为溶剂回流提取做进一步探索。
2.2设计方法
乙醇回流提取总黄酮的均匀实验：均匀实验均匀性原则是试验设计优化重要原则之一。在试验设计的方案设计中，使试验点按一定规律充分均匀地分布在试验区域内，每个试验点都具有一定的代表性，则称该方案具有均匀性。用正交表安排试验，均匀性受到一定限制，因而试验点的代表性不够强。若在试验设计中，不考虑综合可比性的要求，完全满足均匀性的要求，让试验点在这种完全从均匀性出发的试验设计方法，称为均匀试验设计。均匀试验设计相对于全面试验和正交试验设计的最主要的优点是大幅度地减少试验次数，缩短试验周期，从而大量节约人工和费用。对于试验因素较多，特别是对于因素多而又希望试验次数少的试验，对于筛选因素或收缩试验范围进行逐步择优的场合，对于复杂数学试验的择优计算等，均匀试验设计是非常有效的试验设计方法[9-12]。
3 结果与分析
实验条件：浸泡时间：1h；提取次数：3次；水浴温度：85℃~90℃；萃取次数：6次。
将数据输入均匀设计软件进行多元二次回归分析, 得回归方程如下:
Y=0.3413+0.0563X1+0.0082X2-0.0194X3-0.0020X1*X1+0.0011X2+
0.0015X3*X3-0.0004X2*X3
据此可得的最佳优化结果见表1。
表1 优化实验结果
根据数据分析结果将得出的最好结果X1=14，X2=15，X3=15做三次验证。即优化的补骨脂中黄酮类的最佳提取工艺为：乙醇浓度(92%)、时间(100min)、料液比(9倍)。我们按此结果进行了验证实验，验证结果如表2：
表2 验证实验结果
因素 1 2 3
浓度/% 92 92 92
料液比 9倍 9倍 9倍
提取时间/min 100min 100min 100min
产量 1.0144g 1.1325g 1.0786g
结果表明，优化条件下总黄酮的产量平均值为1.0752g。
4讨论
4.1 补骨脂的主要化学成分为香豆素和黄酮
现代中药研究不单注重于其中药的治证，更注重于现代药理作用，随着中药现代研究的大力发展，人们开始寻求一种更好的方法来充分利用中药的有效成分。提取方法主要有溶剂法和水提法，本实验通过不同提取工艺对补骨脂黄酮类化合物溶出的影响进行分析, 拟寻求出补骨脂中黄酮的最佳提取方法。水提法虽然收到了一定的成效, 但水溶性杂质多，且补骨脂含有大量糖分和油脂，易发生皂化反应形成胶状物，难以过滤。用有机溶剂回流提取效率颇高，不同提取方法提取补骨脂黄酮的含量有差异。氯仿毒性较大,价格贵，用量较大且回收液无法重复利用,用乙醇回流提取既经济效率又高。对提取液的后处理中，捏溶法往往因为无法捏溶完全，收率明显低于萃取法，因此我们选用萃取法对提取液做后续处理。
4.2水浴回收乙醇过程中，乙醇要挥尽，否则可能会因黄酮溶于乙醇导致收率下降
水溶性杂质（如糖类）无法通过静置分层除去。碱液萃取时水溶性杂质进入碱液层，为了保证浓缩液能完全被萃取出，萃取6次，碱液量较大，酸沉抽滤，滤过较慢，影响实验效率。
4.3用碱性溶剂提取黄酮时，碱性不宜过强，以免在强碱下加热破坏黄酮类化合物母核，在加酸化时，酸性也不宜过强，以免生成佯盐，致使析出的黄酮类化合物又重新溶解减低产品收率。所以本实验提取和萃取用5% Na2CO3溶液，酸化用稀盐酸。补骨脂醇提、回收乙醇后, 黑色粘稠层中黄酮和香豆素的含量远比水溶性部位高，现代研究表明补骨脂用有机溶剂提取后, 得到含有补骨脂查而酮、异补骨脂查而酮等黄酮类化合物的提取液, 该提取液具有增加骨强度和加速骨矿化的作用, 可用于骨质疏松症、软骨病和其它骨病的治疗。本实验选用均匀实验法优化实验条件, 大大提高了补骨脂中总黄酮的收率，为大规模提取治疗骨质疏松的药物提供了理论依据。
参考文献
[1]吉力，徐植灵.补骨脂化学成分的综述[J].中国中药杂志，1995,20(2)：120.
[2]黄剑，赵陆华，邹巧根等.补骨脂化学成分及药理研究进展[J].药学进展，2000,24(4):212
[3] 郭江宁，吴侯，翁新楚等.补骨脂中活性成分的分离与抗癌实验研究[J].中药材，2003,26(3):185.
[4]Yun-Ting Hsu,Chih-Jen Wu,Jing-Ming Chen,et al.The Presence of Three Isoflavonoid Compounds in Psoralea corylifolia [J].Journal of Chromatographic Science,2001,39(10):441.
[5]杨敏，刘娟. 不同提取工艺对补骨脂黄酮溶出的影响[J].中药兽医学杂志.2004，120（5）.
[6]余得平.不同含量乙醇提取补骨脂的比较[J].时珍国医国药,2000, 11 (7)：592.
[7]杨帆，金描真,宋凤兰,等.补骨脂提取工艺的比较研究[J].中国中药杂志，2005,16（30）：1290.
[8]罗志冬,郭晏华.补骨脂有效成分提取工艺的考察[J].中国新药杂志.2001，45(6).
[9]胡海山，朱群英，罗美玲.均匀实验设计优化金银花总黄酮的提取.江西省分析测试研究所编.
[10]黄何民，周刚.均匀设计法对怀菊花总黄酮提取工艺的研究.河南省中医药研究所编.
[11]张梦军，覃仁辉，聂金媛.从银杏叶中提取银杏黄酮苷的工艺比较及实验优化.第三军医大学学报.
[12]中国科学院上海药物研究所编.中草药有效成分提取与分离(第二版),上海:上海科学技术出版社,1983年版:327,23.
【关键词】 补骨脂；总黄酮；提取工艺；均匀实验
补骨脂为豆科植物补骨脂(Psoralea corylifolia L)的干燥成熟果实，是一味常用中药，其味辛苦、性温，具有温肾助阳、温中止泻之功效。现代药理研究表明补骨脂有舒张支气管平滑肌、抗衰老、抗菌、抗肿瘤和扩张冠状动脉的作用[1-3]。另有研究表明补骨脂中的黄酮类成分可能具有防止骨吸收、增加骨密度的雌激素样作用[4]。香豆素类和黄酮类是补骨脂中的主要有效成分，目前科研工作者较多进行的是补骨脂中香豆素类的提取分离，而对于黄酮类的研究尚少，因此我们对补骨脂中的黄酮类的提取方法进行了探索，以期进一步对其药理作用进行研究。
1实验仪器与试剂
HH-S型水浴锅，巩义市英峪予华仪器厂；SHZ-95型循环水式多用真空泵，巩义市杜甫仪器厂；分析天平,梅特勒AE240电子分析天平；倾斜式高速万能粉碎机，北京中兴伟业仪器有限公司；补骨脂，市售药材，经河南中医学院生药学科鉴定为豆科植物补骨脂；试剂均为分析纯。
2实验方法
2.1提取方法与结果
考虑到黄酮类在乙醇和氯仿中溶解度较好，所以我们分别选用了乙醇和氯仿作为溶剂进行回流提取，并与水提法进行了比较。
2.1.1 乙醇回流提取法：将补骨脂粉碎成细粉，取200g均分成4份，加入80%，70%，60%，50%乙醇溶液200ml浸泡过夜，次日水浴回流提取30min，用脱脂棉过滤，滤液回收乙醇至无醇味，混悬液放置过夜，次日分层，倾去水层，用少量水洗去粘稠性杂质，得黑色膏状物，加氯仿1:1热溶，滤过，滤液用5% Na2CO3萃取三次，合并，加盐酸调pH至酸性，溶液析出沉淀，抽滤，即得黄酮粗品[5、6]。
2.1.2 氯仿回流提取法：补骨脂粉50g，加氯仿于水浴70℃上回流提取1h，脱脂棉过滤，得滤液，加入碳酸氢钠溶液除去带羧基的有机酸杂质，再5%Na2CO3溶液1:1分别萃取三次，合并萃取液，加盐酸调pH至溶液pH2~3，析出沉淀，抽滤，得到黄酮粗品[7、8]。
2.1.3碱溶酸沉法：补骨脂粉50g，加入100ml5%Na2CO3溶液浸泡1h，脱脂棉过滤，滤液加盐酸调pH至酸性，即析出沉淀，抽滤,即得总黄酮粗品。
2.1.4煎煮法：补骨脂粉50g，0.2%NaOH溶液150ml电炉上煮沸1h，香豆素内酯环开环并改变构象，脱脂棉过滤，滤液加盐酸调PH至酸性，析出沉淀，抽滤，将沉淀溶于碳酸氢钠溶液，至不再溶解为度，抽滤,即得总黄酮，既排除了有机酸的干扰，又出去了香豆素的不同构象衍生物。
2.1.5结果：实验结果表明氯仿作为溶剂回流所得总黄酮产率较之乙醇低，且氯仿价格较贵，毒性较大；水提法较之回流法效率差，杂质多，故我们选择了乙醇为溶剂回流提取做进一步探索。
2.2设计方法
乙醇回流提取总黄酮的均匀实验：均匀实验均匀性原则是试验设计优化重要原则之一。在试验设计的方案设计中，使试验点按一定规律充分均匀地分布在试验区域内，每个试验点都具有一定的代表性，则称该方案具有均匀性。用正交表安排试验，均匀性受到一定限制，因而试验点的代表性不够强。若在试验设计中，不考虑综合可比性的要求，完全满足均匀性的要求，让试验点在这种完全从均匀性出发的试验设计方法，称为均匀试验设计。均匀试验设计相对于全面试验和正交试验设计的最主要的优点是大幅度地减少试验次数，缩短试验周期，从而大量节约人工和费用。对于试验因素较多，特别是对于因素多而又希望试验次数少的试验，对于筛选因素或收缩试验范围进行逐步择优的场合，对于复杂数学试验的择优计算等，均匀试验设计是非常有效的试验设计方法[9-12]。
3 结果与分析
实验条件：浸泡时间：1h；提取次数：3次；水浴温度：85℃~90℃；萃取次数：6次。
将数据输入均匀设计软件进行多元二次回归分析, 得回归方程如下:
Y=0.3413+0.0563X1+0.0082X2-0.0194X3-0.0020X1*X1+0.0011X2+
0.0015X3*X3-0.0004X2*X3
据此可得的最佳优化结果见表1。
表1 优化实验结果
根据数据分析结果将得出的最好结果X1=14，X2=15，X3=15做三次验证。即优化的补骨脂中黄酮类的最佳提取工艺为：乙醇浓度(92%)、时间(100min)、料液比(9倍)。我们按此结果进行了验证实验，验证结果如表2：
表2 验证实验结果
因素 1 2 3
浓度/% 92 92 92
料液比 9倍 9倍 9倍
提取时间/min 100min 100min 100min
产量 1.0144g 1.1325g 1.0786g
结果表明，优化条件下总黄酮的产量平均值为1.0752g。
4讨论
4.1 补骨脂的主要化学成分为香豆素和黄酮
现代中药研究不单注重于其中药的治证，更注重于现代药理作用，随着中药现代研究的大力发展，人们开始寻求一种更好的方法来充分利用中药的有效成分。提取方法主要有溶剂法和水提法，本实验通过不同提取工艺对补骨脂黄酮类化合物溶出的影响进行分析, 拟寻求出补骨脂中黄酮的最佳提取方法。水提法虽然收到了一定的成效, 但水溶性杂质多，且补骨脂含有大量糖分和油脂，易发生皂化反应形成胶状物，难以过滤。用有机溶剂回流提取效率颇高，不同提取方法提取补骨脂黄酮的含量有差异。氯仿毒性较大,价格贵，用量较大且回收液无法重复利用,用乙醇回流提取既经济效率又高。对提取液的后处理中，捏溶法往往因为无法捏溶完全，收率明显低于萃取法，因此我们选用萃取法对提取液做后续处理。
4.2水浴回收乙醇过程中，乙醇要挥尽，否则可能会因黄酮溶于乙醇导致收率下降
水溶性杂质（如糖类）无法通过静置分层除去。碱液萃取时水溶性杂质进入碱液层，为了保证浓缩液能完全被萃取出，萃取6次，碱液量较大，酸沉抽滤，滤过较慢，影响实验效率。
4.3用碱性溶剂提取黄酮时，碱性不宜过强，以免在强碱下加热破坏黄酮类化合物母核，在加酸化时，酸性也不宜过强，以免生成佯盐，致使析出的黄酮类化合物又重新溶解减低产品收率。所以本实验提取和萃取用5% Na2CO3溶液，酸化用稀盐酸。补骨脂醇提、回收乙醇后, 黑色粘稠层中黄酮和香豆素的含量远比水溶性部位高，现代研究表明补骨脂用有机溶剂提取后, 得到含有补骨脂查而酮、异补骨脂查而酮等黄酮类化合物的提取液, 该提取液具有增加骨强度和加速骨矿化的作用, 可用于骨质疏松症、软骨病和其它骨病的治疗。本实验选用均匀实验法优化实验条件, 大大提高了补骨脂中总黄酮的收率，为大规模提取治疗骨质疏松的药物提供了理论依据。
参考文献
[1]吉力，徐植灵.补骨脂化学成分的综述[J].中国中药杂志，1995,20(2)：120.
[2]黄剑，赵陆华，邹巧根等.补骨脂化学成分及药理研究进展[J].药学进展，2000,24(4):212
[3] 郭江宁，吴侯，翁新楚等.补骨脂中活性成分的分离与抗癌实验研究[J].中药材，2003,26(3):185.
[4]Yun-Ting Hsu,Chih-Jen Wu,Jing-Ming Chen,et al.The Presence of Three Isoflavonoid Compounds in Psoralea corylifolia [J].Journal of Chromatographic Science,2001,39(10):441.
[5]杨敏，刘娟. 不同提取工艺对补骨脂黄酮溶出的影响[J].中药兽医学杂志.2004，120（5）.
[6]余得平.不同含量乙醇提取补骨脂的比较[J].时珍国医国药,2000, 11 (7)：592.
[7]杨帆，金描真,宋凤兰,等.补骨脂提取工艺的比较研究[J].中国中药杂志，2005,16（30）：1290.
[8]罗志冬,郭晏华.补骨脂有效成分提取工艺的考察[J].中国新药杂志.2001，45(6).
[9]胡海山，朱群英，罗美玲.均匀实验设计优化金银花总黄酮的提取.江西省分析测试研究所编.
[10]黄何民，周刚.均匀设计法对怀菊花总黄酮提取工艺的研究.河南省中医药研究所编.
[11]张梦军，覃仁辉，聂金媛.从银杏叶中提取银杏黄酮苷的工艺比较及实验优化.第三军医大学学报.
[12]中国科学院上海药物研究所编.中草药有效成分提取与分离(第二版),上海:上海科学技术出版社,1983年版:327,23.