【摘 要】
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目的 构建国人肠道来源产甲酸草酸杆菌(OxCF)甲酰辅酶A转移酶(FCoAT)基因(FRC)和草酰辅酶A脱羧酶(OCoAD)基因(OXC)的重组慢病毒pLenti6.3-FRC-IRES-EGFP和pLenti6.3-OXC-IRES
【机 构】
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华中科技大学同济医学院附属同济医院泌尿外科
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目的 构建国人肠道来源产甲酸草酸杆菌(OxCF)甲酰辅酶A转移酶(FCoAT)基因(FRC)和草酰辅酶A脱羧酶(OCoAD)基因(OXC)的重组慢病毒pLenti6.3-FRC-IRES-EGFP和pLenti6.3-OXC-IRES-DsRED,为高草酸尿症的基因治疗奠定基础.方法 采用Taq高保真DNA聚合酶从OxCF基因组中扩增FRC基因和OXC基因片段,用DNA凝胶回收试剂盒切胶回收,用DNA连接试剂盒将回收产物分别与pMD18-T Simple载体连接获得FRC和OXC的克隆载体,并转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,挑取阳性克隆并测序,筛选携带完整目的基因质粒pMD18T simple-FRC和pMD18T simple-OXC,用BamH Ⅰ酶切获得目的基因,连接FRC和携带绿色荧光蛋白的pLenti6.3/v5DEST-IRES-EGFP,连接OXC与表达红色荧光蛋白的pLenti6.3/v5 DEST-IRES-DsRED,转化DH5α后挑取阳性克隆并测序.构建的慢病毒过表达载体pLenti6.3-FRC-IRES-EGFP和pLenti6.3-OXC-IRES-DsRED转染HEK293T细胞,包装并测滴度.结果 聚合酶链反应(PCR)从OxCF基因组中扩增分获得1.3kb和1.7kb的DNA片段,与Genbank中FRC( U82167)间碱基序列匹配率为95.88％,存在53个碱基的变异；与Genbank中OXC( M77128)间碱基序列匹配率为93.61％,存在109个碱基的变异；测序证实pLenti6.3-FRC-IRES-EGFP和pLenti6.3-OXC-IRES-DsRED分别含有大小正确的正向FRC cDNA和OXC cDNA,转染HEK293T细胞实验24h后,在荧光显微镜下相应可见大量绿色荧光和红色荧光,两种慢病毒滴度分别为1.15×108 TU/ml和9.75×107 TU/ml.结论 成功构建表达OxCF中草酸分解关键基因FRC和OXC的重组慢病毒载体,并通过转染293细胞制备了高滴度慢病毒.
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