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摘要[目的]从麒麟菜中提取溴酚化合物。[方法]以海洋红藻类麒麟菜为原料，采用50%甲醇、50%乙醇、50%丙酮超声提取和95%乙醇、60%乙醇和50%乙醇浸提的方法，最后评价提取物和分离后组分的体外降血糖活性。[结果]50%乙醇浸提的效率最高，且提取物的降血糖活性高达73%，且氯仿∶甲醇=100∶0组分活性最高，达70%。[结论]为进一步开发海南经济藻类及新的降血糖药物提供了依据。
关键词海洋红藻;麒麟菜;溴酚化合物;降血糖活性
中图分类号S-3文献标识码
A文章编号0517-6611（2017）32-0138-02
Extraction and Hypoglycemic Activity of Bromophenols Compounds from Eucheuma muricatum
AN Tingting，LI Lingna，WANG He（Pharmaceutical Institute of Hainan Province，Haikou，Hainan 570311）
Abstract[Objective] The aim was to extract bromine phenolic compounds from Eucheuma muricatum.[Method] The marine red alga Eucheuma was taken as raw materials，and 50% methanol，50% ethanol and 50% acetone ultrasonic extraction and 95% ethanol，60% ethanol and 50% ethanol leaching method were used.Finally，the in vitro hypoglycemic activities of final evaluation extracts and isolated group were evaluated.[Result] The efficiency of ethanol extraction was the highest in 50% ethanol extracts，and the blood glucose activity of the extracts was 73%，and the activity of chloroformmethanol （100∶0） was the highest，reaching 70%.[Conclusion] The results provide theoretical basis for further development of Hainan economic algae and new hypoglycemic agent.
Key wordsRed algae;Eucheuma muricatum;Bromophenols;Hypoglycemic activity
海藻溴酚化合物为海洋生物特有的卤代化合物，大多具有新颖的化学结构及独特的生物活性，是新药宝贵的化合物来源。国内外学者现已从红藻门的松节藻、多管藻等中分离出具有降血糖、抗炎[1]、抗肿瘤[2-4]等活性的溴酚化合物。目前，国内外学者已将海藻溴酚化合物作为治疗糖尿病、动脉粥样硬化、恶性肿瘤等重大疾病的药物，并已获得了发明专利或新药批件[5-6]。海南省热带红藻资源非常丰富，如紫菜、江蓠、海萝、鹧鸪菜、海人草、麒麟菜等，很多在民间药用广泛。笔者从麒麟菜中提取了具有降血糖作用的溴酚化合物，探究了最佳提取方法，并评价了其体外降血糖活性。
1材料与方法
1.1材料UV-2401PC型紫外分光光度计;SK450HP型超声微波清洗仪; SHB-Ⅲ型循环水式多用真空泵（河南郑州江成科工贸有限公司）;TGL-16MC型臺式高速冷冻离心机;OS-100型轨道式振荡仪;98-1-C型数显控温电热套（天津市泰斯特仪器有限公司）;RE-52A型旋转蒸发器（浙江杭州亿捷科技有限公司）;低温冷却液循环泵（浙江杭州亿捷科技有限公司）。
1.2方法
1.2.1麒麟菜方法的优选。
1.2.1.1浸提法。称取10.0 g麒麟菜粉末3份，置于250 mL三角锥形瓶中，分别加入100 mL 95%乙醇、 80%乙醇、 50%乙醇，室温下避光浸提3 d，提取3次。取3次浸提液进行抽滤，将滤液转移至500 mL圆底烧瓶中，加沸石5粒，于65 ℃下减压浓缩至干，向烧瓶中加入25 mL纯化水，超声30 min使其溶解，将溶液转移至50 mL棕色容量瓶中，加纯化水定容，避光密封保存，备用。
1.2.1.2超声提取法。
称取10.0 g麒麟菜粉末3份，置于250 mL三角锥形瓶中，分别加入100 mL 50%甲醇、50%乙醇、 50%丙酮，超声提取30 min，抽滤，滤渣加入100 mL 50%甲醇，超生提取30 min，抽滤，合并滤液于500 mL圆底烧瓶中，加入5粒沸石，75 ℃减压浓缩至干，加入25 mL纯化水，超声30 min使其溶解，将溶液转移至50 mL棕色容量瓶中，加纯化水定容，避光密封保存，备用。
1.2.2不同提取方法中酚类物质的含量测定。
1.2.2.1標准曲线的绘制。取数支50 mL容量瓶，分别加入20 mL纯化水，再分别加入0、0.04、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50、0.80 mg/mL间苯三酚标准液1.0 mL，按最佳试验条件于713 nm波长处测定吸光度。
1.2.2.2样品的测定。取数支50 mL容量瓶，分别加入20.0 mL纯化水、1.0 mL麒麟菜样品3份、3.0 mL 饱和Na2CO3溶液、5.0 mL Folin-Denis试剂，显色70 min，在713 nm波长处测定吸光度。 1.2.3分离前酶活性测定。
取1 mL萃取液于5 mL容量瓶中，N2吹干，加入少量纯化水溶解，定容，备用。
反应体系参照贤景春等[7]方法，优化后如下：0.5 mL 0.1 mmol/L磷酸钾缓冲液（pH 6.8），再加入
100 μL 10 mg/L α-D葡萄糖吡喃苷、0.5 mL样品溶液，混匀，37 ℃保持20 min，加入0.5 mL 2.5 mmol/L PNPG，混匀后37 ℃保持20 min，再加入1 mL 0.2 mol/L Na2CO3溶液终止反应。于405 nm波长处测定吸光值，重复3次，取平均值。同时设空白组和背景组。
1.2.4溴酚化合物的分离。
称取87 g柱层析用硅胶（200～300目）于500 mL烧杯中，加入250 mL氯仿，搅拌均匀，浸泡10 min，使硅胶充分饱和，将硅胶沿玻璃棒缓缓加入到层析柱中，排气泡，静置30 min，打开阀门，放出氯仿。将乙酸乙酯萃取物与在氯仿中增加甲醇梯度洗脱（0～100%）成6个组分，分别标记为A1（氯仿∶甲醇=100∶0）、A2（氯仿∶甲醇=60∶40）、A3（氯仿∶甲醇=40∶60）、A4（氯仿∶甲醇=60∶40）、A5（氯仿∶甲醇=20∶80）、A6（氯仿∶甲醇=0∶100）。分别收集各组分洗脱液于锥形瓶中，将洗脱液转移至100 mL鸡心瓶中，于旋转蒸发器上30 ℃减压浓缩至干。向鸡心瓶内加入少量纯化水，超声溶解，多次洗涤，将洗液转移至25 mL容量瓶中，定容，低温避光冷藏，备用。
1.2.5分离后酶活性。以A1～A6为样品，步骤同“1.2.3”，于405 nm波长处测定吸光度，计算酶活性抑制率。
酶活性抑制率=A空白-（A样品-A背景）A空白×100%
式中，A空白为不加待测样品反应后的吸光值;A样品为加入待测样品反应后的吸光值;
A背景为只加待测样品反应后的吸光值。
2结果与分析
2.1標准曲线线性回归方程为y=1.470 5x-0.003 8，R2=0.999。6组样品的结果见表1，50%丙酮超声提取和50%乙醇超声提取的提取效率相近，50%乙醇浸提的效率最高，故以50%乙醇浸提作为溴酚化合物的最佳提取方法。
参考文献
[1]
张宏利，朱鋐达，骆天红，等.蛋白酪氨酸磷酸酶1B基因多态性与2型糖尿病和肥胖的相关性研究[J].中华内分泌代谢杂志，2006，22（1）：45-48.
[2] 孙雪，徐年军，郭俊明，等.2种海藻溴酚化合物的抗肿瘤作用及其机制研究[J].中国中药杂志，2010，35（9）：1173-1176.
[3] 徐年军.海藻抗肿瘤抗细菌生物活性物质的研究[J].青岛：中国科学院研究生院（海洋研究所），2002.
[4] ZHAO J L，FAN X，WANG S J，et al.Bromophenol derivatives from the red alga Rhodomela confervoids[J].Journal of natural products，2004，67（6）：1032-1035.
[5] 史大永，韓丽君，范晓，等.两种溴酚类化合物在制备治疗恶性肿瘤药物中的应用：CN101342158[P].2009-01-14.
[6] 史大永，范晓，韩丽君，等.溴酚类化合物在制备治疗恶性肿瘤药物中的应用：CN101283998[P].2008-10-15.
[7] 贤景春，梁政超. 龙眼核提取物的α-葡萄糖苷酶抑制活性体外实验的研究[J].食品科技，2010，35（7）：225-227.
关键词海洋红藻;麒麟菜;溴酚化合物;降血糖活性
中图分类号S-3文献标识码
A文章编号0517-6611（2017）32-0138-02
Extraction and Hypoglycemic Activity of Bromophenols Compounds from Eucheuma muricatum
AN Tingting，LI Lingna，WANG He（Pharmaceutical Institute of Hainan Province，Haikou，Hainan 570311）
Abstract[Objective] The aim was to extract bromine phenolic compounds from Eucheuma muricatum.[Method] The marine red alga Eucheuma was taken as raw materials，and 50% methanol，50% ethanol and 50% acetone ultrasonic extraction and 95% ethanol，60% ethanol and 50% ethanol leaching method were used.Finally，the in vitro hypoglycemic activities of final evaluation extracts and isolated group were evaluated.[Result] The efficiency of ethanol extraction was the highest in 50% ethanol extracts，and the blood glucose activity of the extracts was 73%，and the activity of chloroformmethanol （100∶0） was the highest，reaching 70%.[Conclusion] The results provide theoretical basis for further development of Hainan economic algae and new hypoglycemic agent.
Key wordsRed algae;Eucheuma muricatum;Bromophenols;Hypoglycemic activity
海藻溴酚化合物为海洋生物特有的卤代化合物，大多具有新颖的化学结构及独特的生物活性，是新药宝贵的化合物来源。国内外学者现已从红藻门的松节藻、多管藻等中分离出具有降血糖、抗炎[1]、抗肿瘤[2-4]等活性的溴酚化合物。目前，国内外学者已将海藻溴酚化合物作为治疗糖尿病、动脉粥样硬化、恶性肿瘤等重大疾病的药物，并已获得了发明专利或新药批件[5-6]。海南省热带红藻资源非常丰富，如紫菜、江蓠、海萝、鹧鸪菜、海人草、麒麟菜等，很多在民间药用广泛。笔者从麒麟菜中提取了具有降血糖作用的溴酚化合物，探究了最佳提取方法，并评价了其体外降血糖活性。
1材料与方法
1.1材料UV-2401PC型紫外分光光度计;SK450HP型超声微波清洗仪; SHB-Ⅲ型循环水式多用真空泵（河南郑州江成科工贸有限公司）;TGL-16MC型臺式高速冷冻离心机;OS-100型轨道式振荡仪;98-1-C型数显控温电热套（天津市泰斯特仪器有限公司）;RE-52A型旋转蒸发器（浙江杭州亿捷科技有限公司）;低温冷却液循环泵（浙江杭州亿捷科技有限公司）。
1.2方法
1.2.1麒麟菜方法的优选。
1.2.1.1浸提法。称取10.0 g麒麟菜粉末3份，置于250 mL三角锥形瓶中，分别加入100 mL 95%乙醇、 80%乙醇、 50%乙醇，室温下避光浸提3 d，提取3次。取3次浸提液进行抽滤，将滤液转移至500 mL圆底烧瓶中，加沸石5粒，于65 ℃下减压浓缩至干，向烧瓶中加入25 mL纯化水，超声30 min使其溶解，将溶液转移至50 mL棕色容量瓶中，加纯化水定容，避光密封保存，备用。
1.2.1.2超声提取法。
称取10.0 g麒麟菜粉末3份，置于250 mL三角锥形瓶中，分别加入100 mL 50%甲醇、50%乙醇、 50%丙酮，超声提取30 min，抽滤，滤渣加入100 mL 50%甲醇，超生提取30 min，抽滤，合并滤液于500 mL圆底烧瓶中，加入5粒沸石，75 ℃减压浓缩至干，加入25 mL纯化水，超声30 min使其溶解，将溶液转移至50 mL棕色容量瓶中，加纯化水定容，避光密封保存，备用。
1.2.2不同提取方法中酚类物质的含量测定。
1.2.2.1標准曲线的绘制。取数支50 mL容量瓶，分别加入20 mL纯化水，再分别加入0、0.04、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50、0.80 mg/mL间苯三酚标准液1.0 mL，按最佳试验条件于713 nm波长处测定吸光度。
1.2.2.2样品的测定。取数支50 mL容量瓶，分别加入20.0 mL纯化水、1.0 mL麒麟菜样品3份、3.0 mL 饱和Na2CO3溶液、5.0 mL Folin-Denis试剂，显色70 min，在713 nm波长处测定吸光度。 1.2.3分离前酶活性测定。
取1 mL萃取液于5 mL容量瓶中，N2吹干，加入少量纯化水溶解，定容，备用。
反应体系参照贤景春等[7]方法，优化后如下：0.5 mL 0.1 mmol/L磷酸钾缓冲液（pH 6.8），再加入
100 μL 10 mg/L α-D葡萄糖吡喃苷、0.5 mL样品溶液，混匀，37 ℃保持20 min，加入0.5 mL 2.5 mmol/L PNPG，混匀后37 ℃保持20 min，再加入1 mL 0.2 mol/L Na2CO3溶液终止反应。于405 nm波长处测定吸光值，重复3次，取平均值。同时设空白组和背景组。
1.2.4溴酚化合物的分离。
称取87 g柱层析用硅胶（200～300目）于500 mL烧杯中，加入250 mL氯仿，搅拌均匀，浸泡10 min，使硅胶充分饱和，将硅胶沿玻璃棒缓缓加入到层析柱中，排气泡，静置30 min，打开阀门，放出氯仿。将乙酸乙酯萃取物与在氯仿中增加甲醇梯度洗脱（0～100%）成6个组分，分别标记为A1（氯仿∶甲醇=100∶0）、A2（氯仿∶甲醇=60∶40）、A3（氯仿∶甲醇=40∶60）、A4（氯仿∶甲醇=60∶40）、A5（氯仿∶甲醇=20∶80）、A6（氯仿∶甲醇=0∶100）。分别收集各组分洗脱液于锥形瓶中，将洗脱液转移至100 mL鸡心瓶中，于旋转蒸发器上30 ℃减压浓缩至干。向鸡心瓶内加入少量纯化水，超声溶解，多次洗涤，将洗液转移至25 mL容量瓶中，定容，低温避光冷藏，备用。
1.2.5分离后酶活性。以A1～A6为样品，步骤同“1.2.3”，于405 nm波长处测定吸光度，计算酶活性抑制率。
酶活性抑制率=A空白-（A样品-A背景）A空白×100%
式中，A空白为不加待测样品反应后的吸光值;A样品为加入待测样品反应后的吸光值;
A背景为只加待测样品反应后的吸光值。
2结果与分析
2.1標准曲线线性回归方程为y=1.470 5x-0.003 8，R2=0.999。6组样品的结果见表1，50%丙酮超声提取和50%乙醇超声提取的提取效率相近，50%乙醇浸提的效率最高，故以50%乙醇浸提作为溴酚化合物的最佳提取方法。
参考文献
[1]
张宏利，朱鋐达，骆天红，等.蛋白酪氨酸磷酸酶1B基因多态性与2型糖尿病和肥胖的相关性研究[J].中华内分泌代谢杂志，2006，22（1）：45-48.
[2] 孙雪，徐年军，郭俊明，等.2种海藻溴酚化合物的抗肿瘤作用及其机制研究[J].中国中药杂志，2010，35（9）：1173-1176.
[3] 徐年军.海藻抗肿瘤抗细菌生物活性物质的研究[J].青岛：中国科学院研究生院（海洋研究所），2002.
[4] ZHAO J L，FAN X，WANG S J，et al.Bromophenol derivatives from the red alga Rhodomela confervoids[J].Journal of natural products，2004，67（6）：1032-1035.
[5] 史大永，韓丽君，范晓，等.两种溴酚类化合物在制备治疗恶性肿瘤药物中的应用：CN101342158[P].2009-01-14.
[6] 史大永，范晓，韩丽君，等.溴酚类化合物在制备治疗恶性肿瘤药物中的应用：CN101283998[P].2008-10-15.
[7] 贤景春，梁政超. 龙眼核提取物的α-葡萄糖苷酶抑制活性体外实验的研究[J].食品科技，2010，35（7）：225-227.