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引用：黄倩，韩新才，王文生，等. 在棉花枯萎病新杀菌剂毒力测定中助溶剂的筛选[J]. 棉花科学，2016，38（3）：14-17.
Cite： Huang Qian， Han Xincai， Wang Wensheng， et al. The Cosolvent Screening of New Fungicides in Cotton Fusarium Wilt Toxicity Test[J]. Cotton Sciences， 2016， 38 （3）： 14-17.
摘要：为了筛选对棉花枯萎病新杀菌剂毒力测定没有干扰的安全助溶溶剂。采用生长速率法测定了3种有机溶剂对棉花枯萎病菌的毒力和安全性。结果表明：丙酮、DMF和DMSO对棉花枯萎病菌的EC50值分别是161395.4、2704.8、1848.5 mg/L，以丙酮的毒力最低；其相对安全的质量浓度区间分别为0～161395.4、0～2704.8、0～1848.5 mg/L，抑菌率分别为0～9.2%、0～22.2%、0～6.8%，以丙酮最为安全。因而首选安全助溶有机溶剂为丙酮，其安全质量浓度区间为0～50000 mg/L。
关键词：棉花；枯萎病菌；毒力测定；安全溶剂；助溶剂
中图分类号：S482.92 文献标识码： A 文章编号：2095-3143（2016）03-0014-04
DOI：10.3969/j.issn.2095-3143.2016.03.003
The Cosolvent Screening of New Fungicides in Cotton Fusarium Wilt Toxicity Test
Huang Qian， Han Xincai， Wang Wensheng，
Gao Ling， Yi Ting， Wu Pei， Wu Lina
（Key Laboratory for Green Chemical Process of Ministry of Education， Wuhan Institute of Technology， Wuhan 430073， China）
Abstract： In order to filter out the security cosolvent which has no interference in cotton Fusarium Wilt toxicity test of new fungicides， we adopt the growth rate method testing the toxicity and safety of three kinds of organic solvents for cotton Fusarium Wilt. The rusults show that the EC50 value of acetone， N，N-dimethyl formamide （DMF） and dimethyl sulfoxide （DMSO） of cotton Fusarium Wilt are 161395.4， 2704.8， 1848.5 mg/L， respectively， the toxicity of acetone is the lowest； their mass concentration interval of relative safety are 0～161395.4， 0～2704.8， 0～1848.5 mg/L， the bacteriostatic ratio are 0～9.2%， 0～22.2%， 0～6.8%， respectively， the acetone is the most safe. Thus， the first choice of security organic cosolvent is acetone， its safe mass concentration interval is 0～50000 mg/L.
Key words：Cotton； Fusarium Wilt； Toxicity test； Security solvent； Cosolvent
0引言
棉花是世界上最具经济价值的三大作物之一，棉花枯萎病是由土壤传播的病原菌尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）侵染棉花维管束而引起的一种毁灭性棉花病害[1]，是影响世界棉花高产的重要因素，由于棉花枯萎病防治难度较大，缺乏有效的防治药剂[2-4]，因此，研究开发有效的创新型药剂，是防治棉花枯萎病殷切期望的。
为了有效防治棉花枯萎病，国内外很多学者进行了有效药剂的研发[3-6]，新杀菌剂研发也有一些报道[7]。而在新化合物杀菌活性研究中，必须进行新化合物对棉花枯萎病菌室内毒力测定，但进行新化合物室内毒力测定的问题是相当多的化学合成的新化合物不溶于水，因此，毒力测定时，先要加入有机溶剂助溶。助溶的有机溶剂（简称：助溶剂），如果对棉花枯萎病菌没有杀菌作用，对实验结果就没有干扰，它作为助溶剂就是安全的；如果它有杀菌活性，测定的新化合物的杀菌率和毒力，就包含新化合物与助溶剂两者的杀菌率和毒力，干扰了新化合物的毒力测定结果，它就是不安全的[8]。因此，研究测定助溶剂对棉花枯萎病菌是否有杀菌活性、杀菌毒力大小，筛选出杀菌毒力微小的安全有机助溶剂及其安全添加浓度区间，对于化学合成的新化合物的杀菌活性科学评定以及棉花枯萎病新型杀菌剂的研发具有重要意义。
本文进行丙酮（Acetonc）、N，N-二甲基甲酰胺（N，N- Dimethyl formamide，简称DMF）、二甲基亚砜（Dimethyl sulfoxide，简称DMSO）3种常用有机溶剂对Fusarium oxysporum 的毒力测定和安全性筛选，旨在探明这3种有机溶剂作为助溶剂，在棉花枯萎病新杀菌剂或新化合物杀菌活性测定中的安全性，为棉花枯萎病新杀菌剂毒力测定时，助溶有机溶剂的选择和安全质量浓度设定提供科学依据。 1 材料与方法
1.1供试药剂
丙酮（Acetonc），分析纯AR，国药集团化学试剂有限公司生产；N，N-二甲基甲酰胺（N，N- Dimethyl formamide，简称DMF），分析纯AR，国药集团化学试剂有限公司生产；二甲基亚砜（Dimethyl sulfoxide，简称DMSO），分析纯AR，天津市博迪化工有限公司生产。
1.2 供试菌株
棉花枯萎病菌（Fusarium Wilt）菌株，为华中农业大学生命科学技术学院陈守文教授提供。
1.3 药剂抑菌率测定方法
分别取一定量的以上3种供试药剂，制备一定质量浓度的母液，每种药剂分别用无菌水稀释成5个不同浓度梯度，在无菌工作台上用无菌吸管吸取1 mL药液（以无菌水为对照）加入到直径为7.5 cm培养皿中，再用无菌注射器加入9 mL熔化后的50℃～60℃的PDA培养基，使药剂与培养基混匀，冷却至室温。然后，向培养皿中接种直径为5 mm的棉花枯萎病菌菌块，在28 ℃恒温培养箱中培养5～7 d，待对照接近长满培养皿时，用十字交叉法测量菌落直径，3次重复，取平均值，计算药剂的菌丝抑菌率。
菌丝抑菌率（%）=
1.4 毒力回归分析
以药剂质量浓度的对数值为自变量X，以菌丝抑菌率机率值为因变量Y，计算出毒力回归方程和相关系数R，根据回归方程求出抑菌中质量浓度EC50值。此过程用软件SPSS 16.0计算完成。
2 结果与分析
2.1 有机助溶剂对棉花枯萎病菌的毒力回归分析
实验选择的3种有机助溶剂对棉花枯萎病菌的毒力测定结果见表1。从表1可以看出：丙酮、DMF、DMSO对棉花枯萎病菌的毒力回归方程分别为y=-9.8235 2.8425x、y=-0.5508 1.6224x、y=-2.2364 1.6961x；建立该回归方程的相关系数（R）分别为0.9805、0.9805、0.9979，相关性较好；抑菌中质量浓度EC50值分别为163195.4、2704.8、1848.5 mg/L。根据EC50的大小，EC50值越小，表明毒力越大，3种不同有机溶剂对棉花枯萎病菌的毒力大小为：DMSO>DMF>丙酮。毒力越大，作为助溶剂，对新杀菌剂或新化合物杀菌毒力测定干扰就越大，越不安全。 因此，助溶剂的安全性与毒力相反，这三种助溶剂的安全顺序是丙酮>DMF>DMSO。
2.2 有机助溶剂对棉花枯萎病菌的菌丝生长抑制作用和安全性分析
3种不同有机溶剂，在不同质量浓度区间对棉花枯萎病菌的抑菌作用不同（表2）。丙酮、DMF和DMSO分别在0～50000、0～1250 和0～2500 mg/L质量浓度区间，对棉花枯萎病菌都有抑菌活性，其抑菌率分别为0～9.2%、0～22.2%和0～6.8%（表2），说明上述3种有机溶剂在各自不同质量浓度区间，对棉花枯萎病菌均有一定的杀灭效果，它们用作棉花枯萎病新杀菌剂或新化合物毒力测定的助溶剂，都具有一定的不安全性，都不是绝对安全的。
同时，从表2可以看出，3种有机溶剂，其各自最低抑菌质量浓度和最低抑菌率不同。丙酮、DMF和DMSO三种有机溶剂在质量浓度分别低至50000、1250、2500 mg/L时，其对棉花枯萎病菌的抑菌率分别为9.2%、22.2%、6.8%；作为助溶剂，这3种有机溶剂的相对安全的质量浓度区间分别为0～50000、0～1250、0～2500 mg/L，其抑菌率分别为0～9.2%、0～22.2%、0～6.8%。因为丙酮的质量浓度50000 mg/L比DMSO的质量浓度2500 mg/L高20倍，而抑菌率差异不大，分别为9.2%、6.8%，说明丙酮的安全性高于DMSO约20倍。因此，在三种有机溶剂中，最安全的助溶剂是丙酮，其相对的安全质量浓度区间为0～50000 mg/L。
3 讨论
在农药新杀菌剂杀菌活性的毒力测定中，对不溶于水的新化合物，添加少量有机溶剂助溶，是很普遍现象，通常认为，加入少量助溶剂对实验结果影响不大。通过研究证明，添加的助溶剂对植物病原菌棉花枯萎病菌均有一定的毒力，这与文献报道的有机助溶剂对草坪褐斑病菌也有一定毒力是类似的 [8]。因此，在新杀菌剂毒力测定之前，进行安全助溶剂筛选和安全质量浓度区间的测定，对新杀菌剂毒力的科学评价具有重要意义。
丙酮、DMF、DMSO除了是最常用的有机溶剂外，它们均有各自的广泛用途[9-10]，有关这三种物质各方面应用的研究报告很多，而作为助溶剂，应用于农药毒力测定工作的研究报告很鲜见 [8]，通过测定3种有机溶剂对棉花枯萎病菌的毒力，进行安全助溶剂的筛选，得出如下结论：（1）丙酮、DMF和DMSO这3种有机溶剂对棉花枯萎病菌的毒力大小为：DMSO>DMF>丙酮，安全性与毒力大小相反，这3种有机溶剂作为助溶剂的安全顺序是：丙酮>DMF>DMSO；（2）丙酮、DMF和DMSO分别在各自不同质量浓度区间，对棉花枯萎病菌都有杀菌活性，因此，这3种有机溶剂作为助溶剂，对棉花枯萎病菌都不是绝对安全；（3）在棉花枯萎病新杀菌剂毒力测定时，这3种有机溶剂的相对安全的质量浓度区间分别为0～50000、0～1250、0～2500 mg/L，在此安全质量浓度区间，其抑菌率分别为0～9.2%、0～22.2%、0～6.8%，其中，首选安全助溶剂为丙酮，其相对安全质量浓度区间为0～50000 mg/L。在新化合物杀菌毒力测定的实际操作中，加入丙酮作为助溶剂的质量浓度远远低于50000 mg/L，因此，丙酮作为安全助溶剂，在棉花枯萎病菌毒力测定中具有一定的应用价值。
通过本实验，基本弄清楚了3种有机溶剂作为助溶剂对棉花枯萎病菌的毒力大小与相对安全质量浓度区间，筛选出了安全助溶剂丙酮以及相对安全的添加质量浓度区间，该实验结果为棉花枯萎病新的杀菌剂研发和应用，提供了一定的科学依据。
参考文献
[1] 马存，简桂良，郑传临. 中国棉花抗枯黄萎病育种50年[J]. 中国农业科学，2002，35（5）：508-513.
[2] 张爱萍. 棉花枯萎病病原鉴定研究进展[J]. 中国果菜，2008（5）：46.
[3] 刘峰，何茂华，杨连来，等. 几种杀菌剂对棉花枯萎病菌毒力及使用技术研究[J]. 棉花学报，2005，17（6）：380-381.
[4] 韩新才，彭坤波，李喜书，等. 农抗120与多菌灵混配对棉花枯萎病菌的增效作用研究[J]. 棉花学报，2008，20（3）：391-393.
[5] 韩新才，张林，彭华松，等. 几种药剂对棉花枯萎病菌的毒力测定[J]. 武汉工程大学学报，2009， 31（7）：13-15.
[6] 乔艳艳，李捷，杨兆光. 浅析棉花内生菌及其作为生防因子的研究[J]. 棉花科学，2014，36（1）：8-12.
[7] 马静，韩新才，黄龙，等. 几种新型吡啶酮类杂环化合物对棉花枯萎病菌的毒力测定[J]. 广东化工，2012，39（10）：97-98.
[8] 韩新才，张懿月，严庆庆，等. 在草坪褐斑病新杀菌剂毒力测定中安全助溶溶剂的筛选[J]. 农药，2014，53（11）：842-844.
[9] 陈秀仁，张怀友，田锡义. 二甲基亚砜的性质和应用[J]. 辽宁化工，2000，29（1）：31-35.
[10] 刘兴泉，唐毅，戴汉松，等. 二甲基甲酰胺的生产与应用[J]. 化工科技，2002，10（1）：46-49.
Cite： Huang Qian， Han Xincai， Wang Wensheng， et al. The Cosolvent Screening of New Fungicides in Cotton Fusarium Wilt Toxicity Test[J]. Cotton Sciences， 2016， 38 （3）： 14-17.
摘要：为了筛选对棉花枯萎病新杀菌剂毒力测定没有干扰的安全助溶溶剂。采用生长速率法测定了3种有机溶剂对棉花枯萎病菌的毒力和安全性。结果表明：丙酮、DMF和DMSO对棉花枯萎病菌的EC50值分别是161395.4、2704.8、1848.5 mg/L，以丙酮的毒力最低；其相对安全的质量浓度区间分别为0～161395.4、0～2704.8、0～1848.5 mg/L，抑菌率分别为0～9.2%、0～22.2%、0～6.8%，以丙酮最为安全。因而首选安全助溶有机溶剂为丙酮，其安全质量浓度区间为0～50000 mg/L。
关键词：棉花；枯萎病菌；毒力测定；安全溶剂；助溶剂
中图分类号：S482.92 文献标识码： A 文章编号：2095-3143（2016）03-0014-04
DOI：10.3969/j.issn.2095-3143.2016.03.003
The Cosolvent Screening of New Fungicides in Cotton Fusarium Wilt Toxicity Test
Huang Qian， Han Xincai， Wang Wensheng，
Gao Ling， Yi Ting， Wu Pei， Wu Lina
（Key Laboratory for Green Chemical Process of Ministry of Education， Wuhan Institute of Technology， Wuhan 430073， China）
Abstract： In order to filter out the security cosolvent which has no interference in cotton Fusarium Wilt toxicity test of new fungicides， we adopt the growth rate method testing the toxicity and safety of three kinds of organic solvents for cotton Fusarium Wilt. The rusults show that the EC50 value of acetone， N，N-dimethyl formamide （DMF） and dimethyl sulfoxide （DMSO） of cotton Fusarium Wilt are 161395.4， 2704.8， 1848.5 mg/L， respectively， the toxicity of acetone is the lowest； their mass concentration interval of relative safety are 0～161395.4， 0～2704.8， 0～1848.5 mg/L， the bacteriostatic ratio are 0～9.2%， 0～22.2%， 0～6.8%， respectively， the acetone is the most safe. Thus， the first choice of security organic cosolvent is acetone， its safe mass concentration interval is 0～50000 mg/L.
Key words：Cotton； Fusarium Wilt； Toxicity test； Security solvent； Cosolvent
0引言
棉花是世界上最具经济价值的三大作物之一，棉花枯萎病是由土壤传播的病原菌尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）侵染棉花维管束而引起的一种毁灭性棉花病害[1]，是影响世界棉花高产的重要因素，由于棉花枯萎病防治难度较大，缺乏有效的防治药剂[2-4]，因此，研究开发有效的创新型药剂，是防治棉花枯萎病殷切期望的。
为了有效防治棉花枯萎病，国内外很多学者进行了有效药剂的研发[3-6]，新杀菌剂研发也有一些报道[7]。而在新化合物杀菌活性研究中，必须进行新化合物对棉花枯萎病菌室内毒力测定，但进行新化合物室内毒力测定的问题是相当多的化学合成的新化合物不溶于水，因此，毒力测定时，先要加入有机溶剂助溶。助溶的有机溶剂（简称：助溶剂），如果对棉花枯萎病菌没有杀菌作用，对实验结果就没有干扰，它作为助溶剂就是安全的；如果它有杀菌活性，测定的新化合物的杀菌率和毒力，就包含新化合物与助溶剂两者的杀菌率和毒力，干扰了新化合物的毒力测定结果，它就是不安全的[8]。因此，研究测定助溶剂对棉花枯萎病菌是否有杀菌活性、杀菌毒力大小，筛选出杀菌毒力微小的安全有机助溶剂及其安全添加浓度区间，对于化学合成的新化合物的杀菌活性科学评定以及棉花枯萎病新型杀菌剂的研发具有重要意义。
本文进行丙酮（Acetonc）、N，N-二甲基甲酰胺（N，N- Dimethyl formamide，简称DMF）、二甲基亚砜（Dimethyl sulfoxide，简称DMSO）3种常用有机溶剂对Fusarium oxysporum 的毒力测定和安全性筛选，旨在探明这3种有机溶剂作为助溶剂，在棉花枯萎病新杀菌剂或新化合物杀菌活性测定中的安全性，为棉花枯萎病新杀菌剂毒力测定时，助溶有机溶剂的选择和安全质量浓度设定提供科学依据。 1 材料与方法
1.1供试药剂
丙酮（Acetonc），分析纯AR，国药集团化学试剂有限公司生产；N，N-二甲基甲酰胺（N，N- Dimethyl formamide，简称DMF），分析纯AR，国药集团化学试剂有限公司生产；二甲基亚砜（Dimethyl sulfoxide，简称DMSO），分析纯AR，天津市博迪化工有限公司生产。
1.2 供试菌株
棉花枯萎病菌（Fusarium Wilt）菌株，为华中农业大学生命科学技术学院陈守文教授提供。
1.3 药剂抑菌率测定方法
分别取一定量的以上3种供试药剂，制备一定质量浓度的母液，每种药剂分别用无菌水稀释成5个不同浓度梯度，在无菌工作台上用无菌吸管吸取1 mL药液（以无菌水为对照）加入到直径为7.5 cm培养皿中，再用无菌注射器加入9 mL熔化后的50℃～60℃的PDA培养基，使药剂与培养基混匀，冷却至室温。然后，向培养皿中接种直径为5 mm的棉花枯萎病菌菌块，在28 ℃恒温培养箱中培养5～7 d，待对照接近长满培养皿时，用十字交叉法测量菌落直径，3次重复，取平均值，计算药剂的菌丝抑菌率。
菌丝抑菌率（%）=
1.4 毒力回归分析
以药剂质量浓度的对数值为自变量X，以菌丝抑菌率机率值为因变量Y，计算出毒力回归方程和相关系数R，根据回归方程求出抑菌中质量浓度EC50值。此过程用软件SPSS 16.0计算完成。
2 结果与分析
2.1 有机助溶剂对棉花枯萎病菌的毒力回归分析
实验选择的3种有机助溶剂对棉花枯萎病菌的毒力测定结果见表1。从表1可以看出：丙酮、DMF、DMSO对棉花枯萎病菌的毒力回归方程分别为y=-9.8235 2.8425x、y=-0.5508 1.6224x、y=-2.2364 1.6961x；建立该回归方程的相关系数（R）分别为0.9805、0.9805、0.9979，相关性较好；抑菌中质量浓度EC50值分别为163195.4、2704.8、1848.5 mg/L。根据EC50的大小，EC50值越小，表明毒力越大，3种不同有机溶剂对棉花枯萎病菌的毒力大小为：DMSO>DMF>丙酮。毒力越大，作为助溶剂，对新杀菌剂或新化合物杀菌毒力测定干扰就越大，越不安全。 因此，助溶剂的安全性与毒力相反，这三种助溶剂的安全顺序是丙酮>DMF>DMSO。
2.2 有机助溶剂对棉花枯萎病菌的菌丝生长抑制作用和安全性分析
3种不同有机溶剂，在不同质量浓度区间对棉花枯萎病菌的抑菌作用不同（表2）。丙酮、DMF和DMSO分别在0～50000、0～1250 和0～2500 mg/L质量浓度区间，对棉花枯萎病菌都有抑菌活性，其抑菌率分别为0～9.2%、0～22.2%和0～6.8%（表2），说明上述3种有机溶剂在各自不同质量浓度区间，对棉花枯萎病菌均有一定的杀灭效果，它们用作棉花枯萎病新杀菌剂或新化合物毒力测定的助溶剂，都具有一定的不安全性，都不是绝对安全的。
同时，从表2可以看出，3种有机溶剂，其各自最低抑菌质量浓度和最低抑菌率不同。丙酮、DMF和DMSO三种有机溶剂在质量浓度分别低至50000、1250、2500 mg/L时，其对棉花枯萎病菌的抑菌率分别为9.2%、22.2%、6.8%；作为助溶剂，这3种有机溶剂的相对安全的质量浓度区间分别为0～50000、0～1250、0～2500 mg/L，其抑菌率分别为0～9.2%、0～22.2%、0～6.8%。因为丙酮的质量浓度50000 mg/L比DMSO的质量浓度2500 mg/L高20倍，而抑菌率差异不大，分别为9.2%、6.8%，说明丙酮的安全性高于DMSO约20倍。因此，在三种有机溶剂中，最安全的助溶剂是丙酮，其相对的安全质量浓度区间为0～50000 mg/L。
3 讨论
在农药新杀菌剂杀菌活性的毒力测定中，对不溶于水的新化合物，添加少量有机溶剂助溶，是很普遍现象，通常认为，加入少量助溶剂对实验结果影响不大。通过研究证明，添加的助溶剂对植物病原菌棉花枯萎病菌均有一定的毒力，这与文献报道的有机助溶剂对草坪褐斑病菌也有一定毒力是类似的 [8]。因此，在新杀菌剂毒力测定之前，进行安全助溶剂筛选和安全质量浓度区间的测定，对新杀菌剂毒力的科学评价具有重要意义。
丙酮、DMF、DMSO除了是最常用的有机溶剂外，它们均有各自的广泛用途[9-10]，有关这三种物质各方面应用的研究报告很多，而作为助溶剂，应用于农药毒力测定工作的研究报告很鲜见 [8]，通过测定3种有机溶剂对棉花枯萎病菌的毒力，进行安全助溶剂的筛选，得出如下结论：（1）丙酮、DMF和DMSO这3种有机溶剂对棉花枯萎病菌的毒力大小为：DMSO>DMF>丙酮，安全性与毒力大小相反，这3种有机溶剂作为助溶剂的安全顺序是：丙酮>DMF>DMSO；（2）丙酮、DMF和DMSO分别在各自不同质量浓度区间，对棉花枯萎病菌都有杀菌活性，因此，这3种有机溶剂作为助溶剂，对棉花枯萎病菌都不是绝对安全；（3）在棉花枯萎病新杀菌剂毒力测定时，这3种有机溶剂的相对安全的质量浓度区间分别为0～50000、0～1250、0～2500 mg/L，在此安全质量浓度区间，其抑菌率分别为0～9.2%、0～22.2%、0～6.8%，其中，首选安全助溶剂为丙酮，其相对安全质量浓度区间为0～50000 mg/L。在新化合物杀菌毒力测定的实际操作中，加入丙酮作为助溶剂的质量浓度远远低于50000 mg/L，因此，丙酮作为安全助溶剂，在棉花枯萎病菌毒力测定中具有一定的应用价值。
通过本实验，基本弄清楚了3种有机溶剂作为助溶剂对棉花枯萎病菌的毒力大小与相对安全质量浓度区间，筛选出了安全助溶剂丙酮以及相对安全的添加质量浓度区间，该实验结果为棉花枯萎病新的杀菌剂研发和应用，提供了一定的科学依据。
参考文献
[1] 马存，简桂良，郑传临. 中国棉花抗枯黄萎病育种50年[J]. 中国农业科学，2002，35（5）：508-513.
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[4] 韩新才，彭坤波，李喜书，等. 农抗120与多菌灵混配对棉花枯萎病菌的增效作用研究[J]. 棉花学报，2008，20（3）：391-393.
[5] 韩新才，张林，彭华松，等. 几种药剂对棉花枯萎病菌的毒力测定[J]. 武汉工程大学学报，2009， 31（7）：13-15.
[6] 乔艳艳，李捷，杨兆光. 浅析棉花内生菌及其作为生防因子的研究[J]. 棉花科学，2014，36（1）：8-12.
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[9] 陈秀仁，张怀友，田锡义. 二甲基亚砜的性质和应用[J]. 辽宁化工，2000，29（1）：31-35.
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