【摘 要】
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目的构建人丙氨酸转氨酶（ALT）高效重组表达体系，为ALT相关参考物质的原料制备奠定基础。方法利用生物信息学方法优化编码人ALT核苷酸序列中的密码子，合成人ALT新的基因，并将其克隆至pRSF-Duet表达载体中。重组表达质粒pRSF-Duet-ALT转化大肠埃希菌BL21，以2 mmol/L的异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）诱导目的蛋白的表达，并通过改变诱导剂浓度、振摇速度及诱导温度优化表达条件，
【机 构】
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目的构建人丙氨酸转氨酶（ALT）高效重组表达体系，为ALT相关参考物质的原料制备奠定基础。
方法利用生物信息学方法优化编码人ALT核苷酸序列中的密码子，合成人ALT新的基因，并将其克隆至pRSF-Duet表达载体中。重组表达质粒pRSF-Duet-ALT转化大肠埃希菌BL21，以2 mmol/L的异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）诱导目的蛋白的表达，并通过改变诱导剂浓度、振摇速度及诱导温度优化表达条件，以产生可溶性蛋白。可溶性蛋白经镍离子柱亲和层析及分子筛层析纯化，以十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳( SDS-PAGE)及蛋白质免疫印迹(Western blot)鉴定蛋白的性质，并对重组蛋白的活性、不同储存条件下在血清基质中的稳定性进行检测。
结果经过优化的ALT核苷酸密码子在大肠埃希菌中的使用频率均在10%以上；经表达优化，在IPTG 终浓度为2 mmol/L、25 ℃、150 rpm振摇8 h诱导条件下，可增加可溶性蛋白的产率；纯化后的目的蛋白经电泳及免疫印迹鉴定为谷丙转氨酶，活性可达80 000 U/L。重组ALT在2~8 ℃、25 ℃均可稳定2~8 d，相对偏差均在5%以内。
结论通过密码子优化，成功构建了重组ALT的高效表达系统，本重组蛋白可以达到作为参考物质原料的要求。（中华检验医学杂志，2014,37：767-771）
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