【摘 要】
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目的 构建HW11c40突变体,寻找合适的表达系统表达HW11c40突变体和HWTX-Ⅺ(虎纹捕鸟蛛毒素-Ⅺ),解决HWTX-Ⅺ来源问题和HW11c40改造后毒素难于获取的难题,为合适HW11 c40突变体
【机 构】
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中南大学基础医学院医学寄生虫学系,湖南长沙,410078;中南大学湘雅二医院血液内科分子血液病研究室,湖南长沙,410011;中南大学湘雅二医院血液内科分子血液病研究室,湖南长沙410011;中南大学
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目的 构建HW11c40突变体,寻找合适的表达系统表达HW11c40突变体和HWTX-Ⅺ(虎纹捕鸟蛛毒素-Ⅺ),解决HWTX-Ⅺ来源问题和HW11c40改造后毒素难于获取的难题,为合适HW11 c40突变体的筛选和治疗急性胰腺炎高效新药的研制奠定基础. 方法 用PCR定点突变的方法突变HW11c40相关氨基酸残基,构建HW11c40突变体.HW11c40突变体和HWTX-Ⅺ基因经PCR扩增后插入到pET-40b(+)载体,基因5'端插入肠激酶切割位点,再重组到大肠埃希菌BL21 (DE3)进行原核周质表达,获得相应的融合蛋白并进行SDS-PAGE鉴定,用镍柱纯化融合蛋白.融合蛋白用肠激酶酶切,释放出的目的蛋白用Tricine-SDS-PAGE进行鉴定,用镍柱分离目的蛋白,进行高效液相色谱进行进一步分离纯化后作质谱鉴定.对HW11c40突变体和HWTX Ⅺ的表达时间、温度和IPTG浓度进行优化. 结果 成功获得HW 11 c40的4个突变体,并正确构建HW11c40突变体和HWTX-Ⅺ的原核表达载体.经SDS-PAGE和Tricine-SDS-PAGE鉴定,重组质粒转化菌在无IPTG诱导的情况下成功表达所有HW11c40突变体和HWTX-Ⅺ的融合蛋白,经肠激酶酶切均获得对应的目的蛋白,其中HWTX-Ⅺ表达量为3.4 mg/L. 结论 成功构建出HW11c40突变体和HWTX-Ⅺ的重组质粒并在原核细胞内高效表达出相应的目的蛋白,开辟了基因工程表达HWTx-XⅪ的新途径,同时解决了 HW11c40改造后毒素获取难题,突破了整个系列研究的瓶颈,为突变体的筛选及治疗急性胰腺炎高效新药的研制奠定了基础.
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