【摘 要】
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目的 利用指数富集配体系统进化(SELEX)技术筛选能与结核分枝杆菌MPT64蛋白特异结合的寡核苷酸适配子.方法 体外合成长度为78个核苷酸的随机ssDNA文库,利用SEL-EX技术筛选,以MPT64蛋白为靶物质进行12轮筛选,利用生物素-亲和素显色系统检测寡核苷酸与蛋白的结合性.结果 SELEX技术筛选MPT64蛋白适配子的技术体系:PCR扩增的最佳退火温度为65℃;文库优化时,最佳Mg2+的浓
【机 构】
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200433,同济大学附属上海市肺科医院,上海市结核重点实验室,200433,同济大学附属上海市肺科医院,上海市结核重点实验室,200433,同济大学附属上海市肺科医院,上海市结核重点实验室,2004
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目的 利用指数富集配体系统进化(SELEX)技术筛选能与结核分枝杆菌MPT64蛋白特异结合的寡核苷酸适配子.方法 体外合成长度为78个核苷酸的随机ssDNA文库,利用SEL-EX技术筛选,以MPT64蛋白为靶物质进行12轮筛选,利用生物素-亲和素显色系统检测寡核苷酸与蛋白的结合性.结果 SELEX技术筛选MPT64蛋白适配子的技术体系:PCR扩增的最佳退火温度为65℃;文库优化时,最佳Mg2+的浓度为1.5 mmol/L;不对称PCR法制备ssDNA时,Mg2+的浓度为0.75 mmol/L;以酶联板为介质筛选时,在10轮后筛选达到饱和,且随着筛选轮数的增加,PCR扩增产物的电泳条带逐渐单一、致密,亲和性检测显示第10轮获得的适配子库,比初始的文库亲和性吸光度(A)值增加了9.18倍.将适配子库克隆,随机挑取10个单克隆子,利用混合夹心法检测其与MPT64的亲和性,亲和性范围分布在0.572～1.606之间.结论 已初步筛选到与MPT64蛋白高亲和性结合的DNA适配子。
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