【摘 要】
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目的构建携带增强绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)和胶质细胞源性神经营养因子(glial cell line-derived neurotrophic factor,GDNF)基因的慢病毒载
【机 构】
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复旦大学附属眼耳鼻喉科医院耳鼻喉科; 复旦大学上海医学院解剖与组织胚胎学系;
【基金项目】
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国家自然科学基金面上项目资助(30572017)
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目的构建携带增强绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)和胶质细胞源性神经营养因子(glial cell line-derived neurotrophic factor,GDNF)基因的慢病毒载体,转染原代培养的神经干细胞(neural stem cell,NSC),观察能否获得持续的GDNF表达。方法采用聚合酶链反应扩增,限制性内切酶酶切,T4DNA连接酶连接,将GDNF插入慢病毒主体载体pGC-FU,构建重组慢病毒载体(lenti-CMV-GDNF-EGFP)。将构建成功的慢病毒三质粒系统通过Lipofectamine 2000转染于人胚肾细胞系(293T),测定病毒滴度。感染NSC,荧光显微镜下观察EGFP的表达。流式细胞仪检测转染效率,Western blot检测GDNF的表达,酶联免疫吸附测定法检测NSC转染后释放GDNF的量。结果构建的慢病毒载体能高效感染NSC,转染效率达77.7%,3个月后仍有73.7%,Western blot的结果表明GDNF成功在细胞内表达,而酶联免疫吸附测定法表明转染后细胞外分泌GDNF的量随着时间的推移增多,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论构建携带EGFP和GDNF基因的慢病毒载体,并感染NSC,能使之持续表达GDNF。
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