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摘要：应用酸性染料比色法测定蝙蝠葛根、茎、叶中总生物碱随季节性变化规律。以蝙蝠葛碱为对照品，溴甲酚绿为显色剂，pH4的邻苯二甲酸氢钾——氢氧化钠为缓冲溶液，在280纳米处测定其各部位吸光度，结果在1.7～10.2微克/毫升范围内线性良好，回归方程为A=0.0783C+0.1839，R2=0.9997（n=6）。平均加样回收率100.64%，RSD=0.83%。根中总生物碱含量在春季最高后下降再上升；茎中总生物碱含量在6月中旬左右最高，秋季最低；叶中总生物碱含量在春季最高后一直下降。
关键词：蝙蝠葛；总生物碱；酸性染料比色法
项目支持：吉林农业科技学院大学生创新项目
中图分类号： R284 文献标识码： A DOI编号： 10.14025/j.cnki.jlny.2014.21.0015
蝙蝠葛（ Menispermum dauricum DC ）为防己科蝙蝠葛属植物，分布我国东北、华北地区及日本、朝鲜、蒙古等国[1]。其具清热解毒，祛风止痛。用于咽喉肿痛，热毒泻痢，风湿痹痛[2]。北豆根为其药用部分，为植物干燥的根茎，北豆根水煎液与流浸膏低剂量具有明显的抗炎镇痛作用[2]。蝙蝠葛碱常温下比较稳定，光照可以引起其降解，应避光阴凉处保存[3]。
本文采用蝙蝠葛碱为对照品，溴甲酚绿为显色剂，pH4的邻苯二甲酸氢钾——氢氧化钠为缓冲溶液的紫外分光光度法，以建立蝙蝠葛中总生物碱的含量测定曲线，确定蝙蝠葛不同部位的总生物碱季节性变化规律，为研究和开发蝙蝠葛资源提供质量评价手段。
1 材料与方法
1.1 仪器与材料
紫外可见光分光光度计（津岛UV-1600，北京普析通用仪器有限责任公司），SY-360超声波清洗器（上海宁商超声仪器有限公司）；TDL-4离心机（上海安亭科学仪器厂制造）；蝙蝠葛碱标准品（B-032-130519成都瑞芬思生物科技有限公司）；蝙蝠葛植物采摘于吉林猴石山，经鉴定为正品。采摘其根，茎，叶。采集日期分别为5月30日，6月20日，7月15日，8月30日，9月20日（此时部分叶片已经开始枯萎）。其他试剂均为分析纯。
1.2 试验方法
1.2.1 对照品溶液的制备 精确称取蝙蝠葛碱标准品8毫克，置25毫升容量瓶中，加无水乙醇超声30分钟溶解定容至刻度，即得浓度为 0.32毫克/毫升 对照品溶液。
1.2.2 样品溶液的制备 将蝙蝠葛植物置于50℃干燥，用粉碎机粉碎，精密称取蝙蝠葛植物根、茎、叶细粉各0.25克，加1.5%稀硫酸 10毫升 室温浸泡24小时，过滤，取滤液加氢氧化钠溶液调pH到9静止12小时，离心，取沉淀 50℃干燥，保存。后将各样品分别溶于10毫升无水乙醇中，超声30分钟，取1毫升加无水乙醇溶于10毫升容量瓶至刻度。
1.2.3 溴甲酚绿缓冲液的制备 分别配制pH3、pH4、pH5的邻苯二甲酸氢钾——氢氧化钠缓冲溶液，加入溴甲酚绿0.035克，使其充分溶解，备用。
1.2.4 显色鉴别 将蝙蝠葛植物根、茎、叶粉末分别用1.5%稀硫酸浸泡12小时，过滤，取滤液分成9组分别加入生物碱沉淀剂：碘化铋钾、碘化汞钾、硅钨酸。如果含有生物碱，加入碘化铋钾的溶液将产生橙黄色沉淀；加入碘化汞钾的溶液将产生白色沉淀，继续加入，沉淀溶解；加入硅钨酸的溶液将产生白色沉淀。
1.2.5 测定波长的选择 用紫外可见分光光度计在200～700纳米波长范围内进行波长扫描，确定最大吸收波长。
1.2.6 测定方法 精密量取对照品溶液和样品溶液各2毫升分别置于内有15毫升氯仿的分液漏斗中，分别加入溴甲酚绿缓冲液各4毫升，振摇1分钟，静置10分钟，再振摇2次，取氯仿层至容量瓶中，为防止水分对测定结果的影响，对照品和样品萃取液都加入无水硫酸钠0.1克，以氯仿萃取的溴甲酚绿缓冲液为空白对照，测吸收度。
1.2.7 缓冲溶液pH的选择 按1.2.6方法，取3组相同浓度的对照品溶液，分别加入pH3、pH4、pH5的溴甲酚绿缓冲溶液4毫升测量，在最大吸收处比较吸光度数值，确定吸光度最高处缓冲溶液的pH值，之后均按此pH测定样品。
1.2.8 方法学考察
线性关系考察。精密量取对照品溶液1毫升、2毫升、3毫升、4毫升、5毫升、6毫升分别置于25毫升容量瓶中，用无水乙醇定容至刻度，摇匀，制成系列浓度的对照品溶液，各取2毫升按1.2.6的方法测定，以吸收度（A）为纵坐标，蝙蝠葛碱浓度（C）为横坐标，绘制标准曲线，建立回归方程。
重复性考察。取同一批同部位蝙蝠葛植物，按1.2.2的方法，平行制备 5 份样品溶液，按1.2.6的方法测定，计算RSD。
精密度考察。取同一样品溶液，进行5次平行试验，按1.2.6的方法测定吸光度，计算RSD。
稳定性考察。精密吸取样品溶液2毫升，对照品溶液2毫升，按1.2.6的方法分别于0、1、2、6、12小时进行测定，测定吸光度，计算RSD。
加样回收率。精密称取5份已知含量的蝙蝠葛碱对照品溶液2毫升，分别加入精确量取5份已知含量的样品溶液2毫升；按1.2.6的方法测定，计算平均加样回收率。
2 结果
2.1 测定波长的选择
因氯仿的截止波长在24纳米，所以测量发现两溶液在280纳米处有最大吸收值。因此，样品和对照品溶液均在280纳米处测吸收度。
2.2 缓冲溶液pH的选择
pH4的缓冲溶液吸光度最高，因此pH4的溴甲酚绿缓冲溶液为最适缓冲溶液。
2.3 方法学考察
2.3.1 线性关系考察 回归方程为：A=0.0783C+0.1839；R2=0.9997，（n=6）结果表明，在1.7～10.2微克/毫升浓度范围内，蝙蝠葛碱与吸光度呈良好的线性关系。 2.3.2 重复性考察 结果RSD=0.83%（n=5），表明重现性良好。
2.3.3 精密度考察 结果RSD=0.55%（n=5），表明精密度良好。
2.3.4 稳定性考察 样品溶液在12小时内稳定，吸光度几乎不变。RSD=1.03%（n=5），表明样品溶液稳定性良好。
2.3.5 加样回收率 平均加样回收率为100.64%，表明方法准确。
2.4 样品含量
按1.2.2和1.2.6方法测定全年内蝙蝠葛不同部位的总生物碱吸光度，将吸光度值带入标准曲线，计算出总生物碱含量，结果如下。
2.4.1 根中总生物碱含量变化 根中总生物碱含量变化见图1：
图1 蝙蝠葛根中总生物碱含量变化
从图1中可以看出：根所含总生物碱含量在春季最高，夏季下降到最低，秋季再上升，但秋季含量较春季偏低一些。
2.4.2 茎中总生物碱含量变化 茎中总生物碱含量变化见图2：
图2 蝙蝠葛茎中总生物碱含量变化
从图2中可以看出：茎所含总生物碱总体呈现上下波动状态，从春季开始逐渐升高到6月20日左右含量最高；之后开始下降，到7月中旬含量达到一个低谷，接着开始上升，到8月末含量达到一个新的高峰；之后开始下降，秋季含量达到最低。
2.4.3 叶中总生物碱含量变化 叶中总生物碱含量变化见图3：
从图3中可以看出：叶中总生物碱含量在春季最高，之后逐渐下降，到秋季最低。
3 结语
一是通过方法学的研究，可以认为本文采用的测定总生物碱的方法准确性好，灵敏度高，稳定性强，可用于蝙蝠葛中总生物碱的含量测定。
二是确定了利用叶中生物碱，应该在春季采摘；利用茎中生物碱应该在6月中旬采摘；而利用根中生物碱应该在春季或秋季采摘。叶中生物碱含量从春节开始逐渐下降，可能与叶的老化，生物碱合成能力降低有关；茎和根中生物碱含量在7月中旬都比较低，可能因为气温较高，生物碱合成速率降低有关。
三是目前在植物蝙蝠葛中，只用其干燥根茎入药，以往文献大多也只研究根中的生物碱含量、成分、药理作用等。杨静伟[4]曾对北豆根中总生物碱的含量进行测定，并未研究不同季节根中总生物碱含量变化规律。于维萍等[5]曾对不同产地北豆根中蝙蝠葛碱含量进行测定，但所购不同地区的北豆根并不能确定是同一月份采摘，对实验准确性有一定影响，并未研究不同季节的根中总生物碱含量变化规律。龚宁[6]曾对蝙蝠葛茎叶中单一生物碱进行研究，但未研究茎叶中总生物碱含量。本文研究了蝙蝠葛不同部位总生物碱含量随季节性变化的规律，说明不同采摘月份对蝙蝠葛总生物碱含量有较大的影响。通过研究，确定了叶和茎中也含有生物碱，春季叶和茎中总生物碱含量都很高，也可以入药。因此，为进一步研究和开发蝙蝠葛资源提供了质量评价手段和理论基础。
参考文献
[1]傅立国，等.中国高等植物，第三卷[M].青岛：青岛出版社，2012：682.
[2]张颖，孙操，关庆超，等.北豆根抗炎镇痛作用的实验研究[J].现代药物与临床，2009，（06）：367-368.
[3]刘全宇，刘文义.北豆根中蝙蝠葛碱的稳定性研究[J].中成药，2011，（05）：884-886.
[4]杨静伟，杨晶凡，李二林.紫外分光光度法测定北豆根总生物碱的含量[J].中国民族民间医药，2013，（13）：7-8.
[5]于维萍，傅春升，陶琳璐.HPLC法对不同产地北豆根中蝙蝠葛碱的测定[J].齐鲁药事，2005，24（3）：143-144.
[6]龚宁.蝙蝠葛茎叶中的生物碱研究[D].西北农林科技大学，2001.
作者简介：孙声远，吉林农业科技学院制药工程学院，学生，研究方向：天然药物化学；通讯作者：张克勤，博士，吉林农业科技学院制药工程学院，教授，研究方向：制药工程。
关键词：蝙蝠葛；总生物碱；酸性染料比色法
项目支持：吉林农业科技学院大学生创新项目
中图分类号： R284 文献标识码： A DOI编号： 10.14025/j.cnki.jlny.2014.21.0015
蝙蝠葛（ Menispermum dauricum DC ）为防己科蝙蝠葛属植物，分布我国东北、华北地区及日本、朝鲜、蒙古等国[1]。其具清热解毒，祛风止痛。用于咽喉肿痛，热毒泻痢，风湿痹痛[2]。北豆根为其药用部分，为植物干燥的根茎，北豆根水煎液与流浸膏低剂量具有明显的抗炎镇痛作用[2]。蝙蝠葛碱常温下比较稳定，光照可以引起其降解，应避光阴凉处保存[3]。
本文采用蝙蝠葛碱为对照品，溴甲酚绿为显色剂，pH4的邻苯二甲酸氢钾——氢氧化钠为缓冲溶液的紫外分光光度法，以建立蝙蝠葛中总生物碱的含量测定曲线，确定蝙蝠葛不同部位的总生物碱季节性变化规律，为研究和开发蝙蝠葛资源提供质量评价手段。
1 材料与方法
1.1 仪器与材料
紫外可见光分光光度计（津岛UV-1600，北京普析通用仪器有限责任公司），SY-360超声波清洗器（上海宁商超声仪器有限公司）；TDL-4离心机（上海安亭科学仪器厂制造）；蝙蝠葛碱标准品（B-032-130519成都瑞芬思生物科技有限公司）；蝙蝠葛植物采摘于吉林猴石山，经鉴定为正品。采摘其根，茎，叶。采集日期分别为5月30日，6月20日，7月15日，8月30日，9月20日（此时部分叶片已经开始枯萎）。其他试剂均为分析纯。
1.2 试验方法
1.2.1 对照品溶液的制备 精确称取蝙蝠葛碱标准品8毫克，置25毫升容量瓶中，加无水乙醇超声30分钟溶解定容至刻度，即得浓度为 0.32毫克/毫升 对照品溶液。
1.2.2 样品溶液的制备 将蝙蝠葛植物置于50℃干燥，用粉碎机粉碎，精密称取蝙蝠葛植物根、茎、叶细粉各0.25克，加1.5%稀硫酸 10毫升 室温浸泡24小时，过滤，取滤液加氢氧化钠溶液调pH到9静止12小时，离心，取沉淀 50℃干燥，保存。后将各样品分别溶于10毫升无水乙醇中，超声30分钟，取1毫升加无水乙醇溶于10毫升容量瓶至刻度。
1.2.3 溴甲酚绿缓冲液的制备 分别配制pH3、pH4、pH5的邻苯二甲酸氢钾——氢氧化钠缓冲溶液，加入溴甲酚绿0.035克，使其充分溶解，备用。
1.2.4 显色鉴别 将蝙蝠葛植物根、茎、叶粉末分别用1.5%稀硫酸浸泡12小时，过滤，取滤液分成9组分别加入生物碱沉淀剂：碘化铋钾、碘化汞钾、硅钨酸。如果含有生物碱，加入碘化铋钾的溶液将产生橙黄色沉淀；加入碘化汞钾的溶液将产生白色沉淀，继续加入，沉淀溶解；加入硅钨酸的溶液将产生白色沉淀。
1.2.5 测定波长的选择 用紫外可见分光光度计在200～700纳米波长范围内进行波长扫描，确定最大吸收波长。
1.2.6 测定方法 精密量取对照品溶液和样品溶液各2毫升分别置于内有15毫升氯仿的分液漏斗中，分别加入溴甲酚绿缓冲液各4毫升，振摇1分钟，静置10分钟，再振摇2次，取氯仿层至容量瓶中，为防止水分对测定结果的影响，对照品和样品萃取液都加入无水硫酸钠0.1克，以氯仿萃取的溴甲酚绿缓冲液为空白对照，测吸收度。
1.2.7 缓冲溶液pH的选择 按1.2.6方法，取3组相同浓度的对照品溶液，分别加入pH3、pH4、pH5的溴甲酚绿缓冲溶液4毫升测量，在最大吸收处比较吸光度数值，确定吸光度最高处缓冲溶液的pH值，之后均按此pH测定样品。
1.2.8 方法学考察
线性关系考察。精密量取对照品溶液1毫升、2毫升、3毫升、4毫升、5毫升、6毫升分别置于25毫升容量瓶中，用无水乙醇定容至刻度，摇匀，制成系列浓度的对照品溶液，各取2毫升按1.2.6的方法测定，以吸收度（A）为纵坐标，蝙蝠葛碱浓度（C）为横坐标，绘制标准曲线，建立回归方程。
重复性考察。取同一批同部位蝙蝠葛植物，按1.2.2的方法，平行制备 5 份样品溶液，按1.2.6的方法测定，计算RSD。
精密度考察。取同一样品溶液，进行5次平行试验，按1.2.6的方法测定吸光度，计算RSD。
稳定性考察。精密吸取样品溶液2毫升，对照品溶液2毫升，按1.2.6的方法分别于0、1、2、6、12小时进行测定，测定吸光度，计算RSD。
加样回收率。精密称取5份已知含量的蝙蝠葛碱对照品溶液2毫升，分别加入精确量取5份已知含量的样品溶液2毫升；按1.2.6的方法测定，计算平均加样回收率。
2 结果
2.1 测定波长的选择
因氯仿的截止波长在24纳米，所以测量发现两溶液在280纳米处有最大吸收值。因此，样品和对照品溶液均在280纳米处测吸收度。
2.2 缓冲溶液pH的选择
pH4的缓冲溶液吸光度最高，因此pH4的溴甲酚绿缓冲溶液为最适缓冲溶液。
2.3 方法学考察
2.3.1 线性关系考察 回归方程为：A=0.0783C+0.1839；R2=0.9997，（n=6）结果表明，在1.7～10.2微克/毫升浓度范围内，蝙蝠葛碱与吸光度呈良好的线性关系。 2.3.2 重复性考察 结果RSD=0.83%（n=5），表明重现性良好。
2.3.3 精密度考察 结果RSD=0.55%（n=5），表明精密度良好。
2.3.4 稳定性考察 样品溶液在12小时内稳定，吸光度几乎不变。RSD=1.03%（n=5），表明样品溶液稳定性良好。
2.3.5 加样回收率 平均加样回收率为100.64%，表明方法准确。
2.4 样品含量
按1.2.2和1.2.6方法测定全年内蝙蝠葛不同部位的总生物碱吸光度，将吸光度值带入标准曲线，计算出总生物碱含量，结果如下。
2.4.1 根中总生物碱含量变化 根中总生物碱含量变化见图1：
图1 蝙蝠葛根中总生物碱含量变化
从图1中可以看出：根所含总生物碱含量在春季最高，夏季下降到最低，秋季再上升，但秋季含量较春季偏低一些。
2.4.2 茎中总生物碱含量变化 茎中总生物碱含量变化见图2：
图2 蝙蝠葛茎中总生物碱含量变化
从图2中可以看出：茎所含总生物碱总体呈现上下波动状态，从春季开始逐渐升高到6月20日左右含量最高；之后开始下降，到7月中旬含量达到一个低谷，接着开始上升，到8月末含量达到一个新的高峰；之后开始下降，秋季含量达到最低。
2.4.3 叶中总生物碱含量变化 叶中总生物碱含量变化见图3：
从图3中可以看出：叶中总生物碱含量在春季最高，之后逐渐下降，到秋季最低。
3 结语
一是通过方法学的研究，可以认为本文采用的测定总生物碱的方法准确性好，灵敏度高，稳定性强，可用于蝙蝠葛中总生物碱的含量测定。
二是确定了利用叶中生物碱，应该在春季采摘；利用茎中生物碱应该在6月中旬采摘；而利用根中生物碱应该在春季或秋季采摘。叶中生物碱含量从春节开始逐渐下降，可能与叶的老化，生物碱合成能力降低有关；茎和根中生物碱含量在7月中旬都比较低，可能因为气温较高，生物碱合成速率降低有关。
三是目前在植物蝙蝠葛中，只用其干燥根茎入药，以往文献大多也只研究根中的生物碱含量、成分、药理作用等。杨静伟[4]曾对北豆根中总生物碱的含量进行测定，并未研究不同季节根中总生物碱含量变化规律。于维萍等[5]曾对不同产地北豆根中蝙蝠葛碱含量进行测定，但所购不同地区的北豆根并不能确定是同一月份采摘，对实验准确性有一定影响，并未研究不同季节的根中总生物碱含量变化规律。龚宁[6]曾对蝙蝠葛茎叶中单一生物碱进行研究，但未研究茎叶中总生物碱含量。本文研究了蝙蝠葛不同部位总生物碱含量随季节性变化的规律，说明不同采摘月份对蝙蝠葛总生物碱含量有较大的影响。通过研究，确定了叶和茎中也含有生物碱，春季叶和茎中总生物碱含量都很高，也可以入药。因此，为进一步研究和开发蝙蝠葛资源提供了质量评价手段和理论基础。
参考文献
[1]傅立国，等.中国高等植物，第三卷[M].青岛：青岛出版社，2012：682.
[2]张颖，孙操，关庆超，等.北豆根抗炎镇痛作用的实验研究[J].现代药物与临床，2009，（06）：367-368.
[3]刘全宇，刘文义.北豆根中蝙蝠葛碱的稳定性研究[J].中成药，2011，（05）：884-886.
[4]杨静伟，杨晶凡，李二林.紫外分光光度法测定北豆根总生物碱的含量[J].中国民族民间医药，2013，（13）：7-8.
[5]于维萍，傅春升，陶琳璐.HPLC法对不同产地北豆根中蝙蝠葛碱的测定[J].齐鲁药事，2005，24（3）：143-144.
[6]龚宁.蝙蝠葛茎叶中的生物碱研究[D].西北农林科技大学，2001.
作者简介：孙声远，吉林农业科技学院制药工程学院，学生，研究方向：天然药物化学；通讯作者：张克勤，博士，吉林农业科技学院制药工程学院，教授，研究方向：制药工程。