猪德尔塔冠状病毒（PDCoV）和猪肠道α冠状病毒（PEAV）是两种新发现的猪传染性冠状病毒，临床上均以腹泻症状为主，症状相似，临床上难以快速诊断。为建立一种快速、准确区分PDCoV和PEAV的二重RT-PCR方法，本研究根据PDCoV和PEAV N基因序列，分别设计2对特异性引物，以阳性质粒为模板，对二重RT-PCR反应条件进行优化，并进行特异性、敏感性试验。结果显示，所建立的方法能够扩增出PDCoV和PEAV的特异性片段，大小分别为690 bp和208 bp，且对猪流行性腹泻病毒（PEDV）、猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）、猪轮状病毒（PRV）和猪圆环病毒2型（PCV2）无扩增条带；对PDCoV和PEAV的最低检测量分别为5.13×10² copies/μL、4.73×10¹ copies/μL。对60份临床腹泻样本病料进行检测，结果PDCoV的检出率为21.6%，未检测出PEAV。本研究所建立的二重RT-PCR方法可用于临床流行病学监测，为快速诊断PDCoV和PEAV提供理论依据和技术支持。